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摘要：目的：通过比较男性不育患者和正常生育男性的精子DNA完整性，比较其差异，探讨精子DNA完整性与男性不育的关系，并建立SCD试验检测精子DNA完整性参考值。方法：对62例志愿者的精液和87例不育患者的精液，应用精子染色质扩散（Sperm Chromatin Dispersion，SCD）试验方法检测精子DNA完整性。应用受试者工作特征曲线（Receive Operating Characteristic Curve，ROC曲线），確立SCD试验的截断点。结果：男性不育患者DNA损伤精子的百分率（29.4%±12.4%），较对照组的（12.9%±4.4%）明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。最大Youden指数为0.682，以DNA碎片精子百分率<20.2%为诊断界值，在ROC曲线下方的面积为0.923，灵敏度约为74.7%，特异度约为93.5%结论：精子DNA完整性异常男性不育有关。鉴别不育患者与正常生育男性精子DNA碎片的阈值为20.2%，建议低于20%的DNA碎片精子百分率为正常参考值。
关键词：男性不育;精子;DNA损伤
【中图分类号】R134 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）04-127-02
目前，全球约有 8 000万对夫妇患有不育症，且发生率逐年增加[1]。已婚夫妇不育症发病率约为15%，其中男性不育症发病率高达30%[2]。由于男性不育的病因复杂，诊断较为困难，约有1/3男性不育患者常规精液分析结果为正常或接近正常[3]。单凭精液常规检测往往不能满足临床诊治的需要[4]。因此，男性不育诊断的重点应从常规的精液检查向高层次的分子生物学、细胞遗传学和生殖免疫学检查发展。
本研究拟应用SCD试验检测精子DNA碎片，比较健康生育男性与临床不育男性精子DNA完整性的差异性，应用受试者特征曲线（Receiver Operating Characteristic Curves， ROC曲线），分析精子DNA碎片对不育患者的诊断价值，探讨其临床应用价值。
材料与方法
一、研究对象
在山东省新泰市妇幼保健计划生育服务中心2014年8月至2015年12月就诊的87例不育患者为不育组，平均年龄34.7±3.9岁（26～43岁）。正常对照组为62名近期生育过的健康成年男性，平均年龄33.8±4.9岁（23～42岁）。所有入选对象均已签署知情同意书。
二、方法
㈠仪器和试剂：OLYMPUS CX31普通光学显微镜购自日本Olympus公司。低溶点琼脂、标准琼脂、二硫苏糖醇（DTT）、三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐-乙二胺四乙酸二钠盐（TBE）缓冲液等均为美国Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯试剂。
㈡ 精液常规分析：按照WHO《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》精液变量参考值的标准进行诊断。
㈢ 精子处理：将精液标本用HTF洗涤2次后，调密度至10-20×106/ml，与1%低熔点琼脂凝胶（1：2.5）混匀，37℃孵育5 min，滴在经过0.65%标准琼脂预处理过的载玻片上，盖上盖玻片，4℃放置5 min。
㈣ SCD实验：
（1）方法：移走盖玻片，室温下浸入0.08 mol/L的盐酸（HCl）内7 min;浸入含0.4 mol/L DTT的精子裂解液内20 min;移入TBE缓冲液中3 min;常规乙醇脱水。所有操作过程要求标本载玻片处于水平状态。
（2）Diff-Quik法染色[3]，普通光学显微镜下观察结果。
（3） 结果判断：每张标本随机观察至少500个精子。大晕环和中晕环表示精子DNA完整无碎片，小晕环、无晕环及退化表示精子DNA断裂为碎片。计数DNA损伤精子数和精子总数。
三、统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，精子DNA碎片百分率、精液常规参数呈正态分布，精液常规分析数据、SCD检测精子DNA碎片数据均以
±s表达;生育组和不育组精子DNA碎片、精液常规参数的比较采用独立样本的t检验。通过多元线性回归，分析各常规精液参数与精子DNA完整性的关系。P<0.05为差异有统计学意义。应用ROC分析，确立精子DNA碎片的正常值。
结果
精液常规分析及精子DNA完整性检测结果如表1所示。不育组精子密度、精子活动率、精子形态及与生育组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。DNA损伤精子百分率的均数在不育组和生育组分别为（29.4±7.3）%和 （12.9±4.4）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
为探讨常规精液参数与精子DNA完整性的关系，应用多元线性回归分析。如表2所示，精液常规参数中，精子密度和精子活动力即前向运动精子DNA损伤精子百分率密切相关（P<0.05）。而患者年龄、精子形态与DNA损伤精子百分率不相关（P>0.05）。 SCD试验检测精子DNA碎片的ROC曲线，见图1。男性不育截断点在精子DNA碎片20.2%处，灵敏度约为74.7%，特异度约为93.5%，获得最大Youden指数。从图1可见，SCD试验检测精子DNA完整性异常导致男性不育的最佳截断点为20.2%，曲线下面積（AUC）为0.923，有统计学意义（P<0.05）。
讨论
一、精子DNA损伤与男性不育的关系
在精子发生过程中， 如果精蛋白替代组蛋白出现异常，就会导致精子单链和双链DNA断裂，精核DNA损伤[5]。本研究中结果显示，不育患者DNA损伤精子百分率大大高于正常生育男性的DNA损伤精子百分率，这与多项类似研究的结论一致。有研究认为多数情况下，精液分析结果异常标本其精子损伤往往比较严重，不育患者精子DNA变性程度明显高于正常生育者，精液常规参数（精子密度、活率和形态学）分析得到的精子质量与精子DNA损伤之间呈显著负相关，而且不育患者中精液参数正常者精子碎片程度显著低于异常者。在本研究中，精液常规参数中，精子密度和精子活动力即前向运动精子DNA损伤精子百分率密切相关（P<0.05）。而患者年龄、精子形态与DNA损伤精子百分率不相关（P>0.05）。精子DNA完整性是一种较好的男性生育预测指标。
二、SCD试验检测精子DNA完整性的临床价值
ROC曲线是对检验项目临床应用性能评价的定量资料进行归纳分析的最常用的统计方法之一，被公认为衡量诊断信息和诊断决策质量的最佳方法，本研究应用ROC曲线进行对SCD的诊断结果进行评价。ROC曲线下面积为0.923，提示SCD在评价男性生育能力方面具有较高的诊断价值。在截断点20.2%处，灵敏度约为74.7%，特异度约为93.5%，获得最大Youden指数。Sergerie等应用TUNEL检测不育患者和正常生育男性精子DNA完整性，同样得出20%的诊断阈值。而在一个大样本多中心的前瞻性研究也得到类似结论，认为18%为SCD试验预测体外受精技术受精率的截断点。
本研究男性不育精子DNA完整性诊断阈值的确立，为临床诊断、治疗提供了依据。
参考文献
[1]Kenneth PR. Y-chromosome deletions and male infertility： state of the art and clinical implications. J Androl， 1998， 9 （3） ： 225-8.
[2]江鱼.男子不育症诊断和治疗进展.中国男科学杂志， 2000， 14（3） ： 5-9.
[3]蒋敏，陈新敏，岳焕勋等.精子形态学分析在男性不育症诊断中的应用. 中国优生与遗传，2007 ，15 （6）： 106-7.
[4]刘德一，Bake HWG.精子功能检测与男性不育诊治的新进展.中华男科学杂志， 2007， 13（2） ： 99-107.
[5]Angelopoulou R， Plastira K， Msaouel P. Spermatozoal sensitive biomarkers to defective protaminosis and fragmented DNA. Reprod Biol Endocrinol， 2007， 5（8）：36-51.
关键词：男性不育;精子;DNA损伤
【中图分类号】R134 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2019）04-127-02
目前，全球约有 8 000万对夫妇患有不育症，且发生率逐年增加[1]。已婚夫妇不育症发病率约为15%，其中男性不育症发病率高达30%[2]。由于男性不育的病因复杂，诊断较为困难，约有1/3男性不育患者常规精液分析结果为正常或接近正常[3]。单凭精液常规检测往往不能满足临床诊治的需要[4]。因此，男性不育诊断的重点应从常规的精液检查向高层次的分子生物学、细胞遗传学和生殖免疫学检查发展。
本研究拟应用SCD试验检测精子DNA碎片，比较健康生育男性与临床不育男性精子DNA完整性的差异性，应用受试者特征曲线（Receiver Operating Characteristic Curves， ROC曲线），分析精子DNA碎片对不育患者的诊断价值，探讨其临床应用价值。
材料与方法
一、研究对象
在山东省新泰市妇幼保健计划生育服务中心2014年8月至2015年12月就诊的87例不育患者为不育组，平均年龄34.7±3.9岁（26～43岁）。正常对照组为62名近期生育过的健康成年男性，平均年龄33.8±4.9岁（23～42岁）。所有入选对象均已签署知情同意书。
二、方法
㈠仪器和试剂：OLYMPUS CX31普通光学显微镜购自日本Olympus公司。低溶点琼脂、标准琼脂、二硫苏糖醇（DTT）、三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐-乙二胺四乙酸二钠盐（TBE）缓冲液等均为美国Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯试剂。
㈡ 精液常规分析：按照WHO《人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》精液变量参考值的标准进行诊断。
㈢ 精子处理：将精液标本用HTF洗涤2次后，调密度至10-20×106/ml，与1%低熔点琼脂凝胶（1：2.5）混匀，37℃孵育5 min，滴在经过0.65%标准琼脂预处理过的载玻片上，盖上盖玻片，4℃放置5 min。
㈣ SCD实验：
（1）方法：移走盖玻片，室温下浸入0.08 mol/L的盐酸（HCl）内7 min;浸入含0.4 mol/L DTT的精子裂解液内20 min;移入TBE缓冲液中3 min;常规乙醇脱水。所有操作过程要求标本载玻片处于水平状态。
（2）Diff-Quik法染色[3]，普通光学显微镜下观察结果。
（3） 结果判断：每张标本随机观察至少500个精子。大晕环和中晕环表示精子DNA完整无碎片，小晕环、无晕环及退化表示精子DNA断裂为碎片。计数DNA损伤精子数和精子总数。
三、统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，精子DNA碎片百分率、精液常规参数呈正态分布，精液常规分析数据、SCD检测精子DNA碎片数据均以±s表达;生育组和不育组精子DNA碎片、精液常规参数的比较采用独立样本的t检验。通过多元线性回归，分析各常规精液参数与精子DNA完整性的关系。P<0.05为差异有统计学意义。应用ROC分析，确立精子DNA碎片的正常值。
结果
精液常规分析及精子DNA完整性检测结果如表1所示。不育组精子密度、精子活动率、精子形态及与生育组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。DNA损伤精子百分率的均数在不育组和生育组分别为（29.4±7.3）%和 （12.9±4.4）%，差异有统计学意义（P<0.05）。
为探讨常规精液参数与精子DNA完整性的关系，应用多元线性回归分析。如表2所示，精液常规参数中，精子密度和精子活动力即前向运动精子DNA损伤精子百分率密切相关（P<0.05）。而患者年龄、精子形态与DNA损伤精子百分率不相关（P>0.05）。 SCD试验检测精子DNA碎片的ROC曲线，见图1。男性不育截断点在精子DNA碎片20.2%处，灵敏度约为74.7%，特异度约为93.5%，获得最大Youden指数。从图1可见，SCD试验检测精子DNA完整性异常导致男性不育的最佳截断点为20.2%，曲线下面積（AUC）为0.923，有统计学意义（P<0.05）。
讨论
一、精子DNA损伤与男性不育的关系
在精子发生过程中， 如果精蛋白替代组蛋白出现异常，就会导致精子单链和双链DNA断裂，精核DNA损伤[5]。本研究中结果显示，不育患者DNA损伤精子百分率大大高于正常生育男性的DNA损伤精子百分率，这与多项类似研究的结论一致。有研究认为多数情况下，精液分析结果异常标本其精子损伤往往比较严重，不育患者精子DNA变性程度明显高于正常生育者，精液常规参数（精子密度、活率和形态学）分析得到的精子质量与精子DNA损伤之间呈显著负相关，而且不育患者中精液参数正常者精子碎片程度显著低于异常者。在本研究中，精液常规参数中，精子密度和精子活动力即前向运动精子DNA损伤精子百分率密切相关（P<0.05）。而患者年龄、精子形态与DNA损伤精子百分率不相关（P>0.05）。精子DNA完整性是一种较好的男性生育预测指标。
二、SCD试验检测精子DNA完整性的临床价值
ROC曲线是对检验项目临床应用性能评价的定量资料进行归纳分析的最常用的统计方法之一，被公认为衡量诊断信息和诊断决策质量的最佳方法，本研究应用ROC曲线进行对SCD的诊断结果进行评价。ROC曲线下面积为0.923，提示SCD在评价男性生育能力方面具有较高的诊断价值。在截断点20.2%处，灵敏度约为74.7%，特异度约为93.5%，获得最大Youden指数。Sergerie等应用TUNEL检测不育患者和正常生育男性精子DNA完整性，同样得出20%的诊断阈值。而在一个大样本多中心的前瞻性研究也得到类似结论，认为18%为SCD试验预测体外受精技术受精率的截断点。
本研究男性不育精子DNA完整性诊断阈值的确立，为临床诊断、治疗提供了依据。
参考文献
[1]Kenneth PR. Y-chromosome deletions and male infertility： state of the art and clinical implications. J Androl， 1998， 9 （3） ： 225-8.
[2]江鱼.男子不育症诊断和治疗进展.中国男科学杂志， 2000， 14（3） ： 5-9.
[3]蒋敏，陈新敏，岳焕勋等.精子形态学分析在男性不育症诊断中的应用. 中国优生与遗传，2007 ，15 （6）： 106-7.
[4]刘德一，Bake HWG.精子功能检测与男性不育诊治的新进展.中华男科学杂志， 2007， 13（2） ： 99-107.
[5]Angelopoulou R， Plastira K， Msaouel P. Spermatozoal sensitive biomarkers to defective protaminosis and fragmented DNA. Reprod Biol Endocrinol， 2007， 5（8）：36-51.