“疼痛”是与业已存在的或潜在的组织损伤联系的不愉快的感觉和情绪体验。疼痛是集团的警告反应，是人类的主要生命指征（呼吸、脉搏、体温、血压等）之一[1]。急性疼痛的意义在于警示作用；与此相反，持续三个月以上，难以治疗的疼痛，称为慢性疼痛。慢性疼痛往往不仅是一种症状，2002年国际疼痛研究会(International association for the srudy of pain IASP)在“第十届世界疼痛大会”上更进一步提出“慢性疼痛就是一类疾病”。与急性疼痛不同的慢性、持续性疼痛对身心健康和生活质量起很大破坏作用，又因持续性及难治性使其成为病人就医的最常见的原因，而日益受到临床医护工作者的重视。　　 N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体是蛋白质复合体，其中心由形成离子通道的多肽亚基组成。典型的NMDA受体分别由功能亚基(NMDAreceptor1，NR1)和调节亚基(NMDA receptor2，NR2)组成。由NR1亚基和NR2亚基构成完整的NMDA受体离子通道，具有与其他离子通道不同的特点：(1)对Ca2+高通透性；(2)在静息膜电位时，NMDA通道被细胞外镁所阻断，只有在同时去极化和结合激动剂的情况下开放；(3)NMDA受体需要同时结合谷氨酸和甘氨酸才能激活[2]。研究表明，无论急性还是慢性疼痛均与NMDA受体的激活增高有关[3]。目前，不同类型的新的镇痛药正在开发之中，以NMDA受体为靶点，设法抑制NMDA受体的激活来治疗疼痛无疑成为研究的热点。抑制NMDA受体过度激活可以使用NMDA受体拮抗剂，也可以通过基因工程的方法抑制NMDA受体的表达等。目前已有的NMDA受体拮抗剂的药用“空间窗”过大和“时间窗”过小等缺陷成为其进入临床的障碍。因此，我们考虑以NMDAR为靶点，应用小干涉RNA沉默NMDAR1基因，抑制其过度激活以治疗慢性疼痛。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是利用双链RNA(double stranded RNA dsRNA)高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的过程，即诱导序列特异的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing PTGS)[4]。RNA干扰技术具有快速、可靠、经济及其特有的简单性和快速性等优点，已经逐渐成为一项极具潜力的基因功能研究技术，为临床上特异性的基因干预治疗开辟了一条通路[5]。　　 要将siRNA成功导入体内，合适的载体是关键，鉴于常用的病毒及非病毒载体存在一定的缺陷，阻碍了其进入临床。由低分子量聚乙烯亚胺(PEI)和胆固醇组成的水溶性脂聚体(water soluble lipopolymer， WSLP)，具有稳定性高及细胞毒性低等优点。Kim等认为，WSLP可透过血脑屏障，具有中枢靶向性，可以成为神经细胞的基因运载体。由于低分子量PEI毒性低，和胆固醇结合后可以增加转染效率。据此，我们推测，利用WSLP，运载NMDAR1/siRNA，抑制脊髓NMDAR的表达来治疗慢性疼痛，有希望成为治疗疼痛的切实可行的新手段。为此，本研究先合成WSLP/siRNA，检测了WSLP/siRNA稳定性以及细胞毒性，然后将WSLP/siRNA转染入细胞，运用RT-PCR及wsetern-blot技术检测其对离体类神经细胞mRNA和蛋白水平的沉默效率，以期证明WSLP在离体条件下可成功运载NMDAR1/siRNA，进而为进一步在体实验打下基础。　　 目的：探寻WSLP运载NMDAR/siRNA抑制NMDAR1表达的可行性，为在体实验打下基础，进而为疼痛的基因治疗寻找切实可行的非病毒载体。　　 方法：　　 1．设计siRNA　　 根据Gene bank中查找到的NMDAR1基因序列，应用Primer Designer软件设计合成双链siRNA。　　 2．合成WSLP/siRNA　　 将WSLP与siRNA按一定质量比混合后，静置30分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳，电子成像确定结果。　　 3．琼脂糖凝胶电泳检测WSLP/siRNA稳定性　　 将WSLP与siRNA以最佳比例合成WSLP/NMDA/siRNA，与单纯NMDA/siRNA分别水浴0，0.5，1，2，3小时后，琼脂糖凝胶电泳，电子成像系统观察结果。　　 4．MTT法检测细胞活力　　 4.1转染　　 4.1.1细胞传代弃去培养皿中的培养基，1mlPBS溶液洗涤两次，加入胰酶，消化1min(37℃5％CO2)。加入1ml含血清培养基终止反应，反复吹打多次使细胞完全分散开。将含有细胞的培养液倒入离心管中，1000rpm5min。细胞计数后，以4X105接种到6孔板上。　　 4.1.2细胞转染将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗2遍后，加入2ml无血清培养基。将质量比为3:1的WSLP/siRNA逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻摇匀。在37℃，5％的CO2中保温5-6小时。7-8小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中培养36小时后检查转染水平。　　 4.2MTT法检测细胞活力　　 细胞计数后以2000个/孔接种于96孔板中，培养24小时后用于实验。将转染了WSLP/siRNA的细胞每孔加入20μl（5mg/ml）MTT试剂，37℃避光培养继续孵育4h，弃去上清加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，室温摇床15min，酶标仪670波长测定OD值。　　 5．RT-PCR及western-blot技术检测WSLP/siRNA抑制PC12细胞基因表达的能力　　 5.1实验分组　　 实验分为3组：　　 ①单纯siRNA组：单纯NMDAR1/siRNA转染PC12细胞进行RT-PCR及western-blot;　　 ②乱序siRNA组：WSLP与乱序siRNA结合后转染PC12细胞进行RT-PCR及western-blot;　　 ③NMDAR1/siRNA组：用WSLP与siRNA/NMDAR1结合转染PC12细胞进行RT-PCR及western-blot。每组实验重复3次。　　 5.2 RT-PCR检测　　 应用Primer Designer软件设计引物，设计出的NMDAR1引物序列，以及乱序.的siRNA序列。PCR扩增片段长度为222bp。　　 RT-PCR:①根据Trizol使用说明书提供的方法提取细胞总RNA。合成cDNA后，50μlPCR反应体系反应程序为预变性：94℃变性5min，94℃1min，PCR反应：63℃30s，72℃40s，72℃10min，4℃终止，30循环。取PCR反应产物10μl经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后EB显色，凝胶成像系统成像。　　 5.3 WesternBlot检测　　 实验前考马斯亮蓝法测定蛋白样品浓度，取同相同蛋白量样品上样，12％SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，湿转法转印到PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温密闭1h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，ECL显色，曝光于X光胶片，通过蛋白预染Marker确定目的条带。分组同RT-PCR检测。　　 结果：　　 1．WSLP与siRNA的最佳质量比在3:1及其以下　　 2．WSLP/NMDA/siRNA的稳定性　　 电泳结果表明，WSLP/NMDA/siRNA在水浴0，0.5，1，2，3小时后，电泳依然显示条带；而单纯NMDA/siRNA在水浴0.5h后即没有电泳条带。　　 3．WSLP/NMDA/siRNA的细胞毒性　　 转染WSLP/NMDA/siRNA的PC12细胞在培养24小时后，其细胞活力与单纯PC12细胞的细胞活里之间没有统计学差异(P＞0.05)。　　 4．WSLP/NMDA/siRNA对于PC12细胞的NMDAR1的沉默效率　　 利用RT-PCR技术分别得到的各组NMDAR1的扩增产物的电泳条带置于凝胶图像分析系统分析，发现RT-PCR目的产物量/β-actin产物量的比值最终结果出现如下变化：WSLP/siRNA组的NMDAR1的mRNA较之单纯siRNA组以及乱序siRNA组的表达水平明显降低；而单纯siRNA组以及乱序siRNA组则未引起PC12细胞NMDAR1的mRNA的明显变化。　　 通过western-blot方法，分别得到了各组NR2B的蛋白电泳条带。电泳条带置于凝胶图像分析系统分析，发现western-blot目的产物量最终结果出现如下变化WSLP/siRNA组的NMDAR1的蛋白表达较之单纯siRNA组以及乱序siRNA组的表达水平明显降低；而单纯siRNA组以及乱序siRNA组则未引起PC12细胞NMDAR1的蛋白表达的明显变化。　　 结论：　　 1.WSLP作为一种基因载体能够与siRNA以一定质量比有效结合；　　 2.WSLP能够在体外有效保护siRNA不被RNA酶水解；　　 3．WSLP/siRNA不论以不同质量比结合转染入细胞后，其相对生长活力均与未转染的细胞无明显差别；　　 4．成功转染siRNA分子进入细胞内后，RT-PCR和Western blott检测分别在mRNA和蛋白质水平上的研究证实了siRNA对靶基因NMDAR1的有较高的沉默效率，说明合成的siRNA/NMDAR1分子能有效沉默靶基因的表达。　　 总之，本研究的结果证明WSLP/NMDAR1/siRNA具有较高的稳定性，以及可忽略不计的细胞毒性。以及WSLP可运载NMDAR1/siRNA在离体条件下有效沉默PC12细胞的NMDAR1的表达。为以后的在体实验打下基础。