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研究背景多发性骨髓瘤（Mutiple myeloma,MM）是主要存在于骨髓的浆细胞恶性肿瘤,以过量产生免疫球蛋白为其主要特征。近年来,随着新的化疗药物和治疗方案的出现,如蛋白酶抑制剂、单克隆抗体、免疫调节剂、自身造血干细胞移植等,MM患者的预后已得到很大的改善,中位生存期从3-5年提高到了8-10年。但是,MM仍然在很大程度上无法治愈,大多数患者仍然会因药物耐药而复发。因此,MM耐药的机制研究具有很重要的临床意义。蛋白酶体抑制剂,如硼替佐米（bortezomib,Bor）和卡非佐米（carfilzomib）基于其副作用小、疗效好的特征,已广泛用于MM的治疗,是临床上治疗MM的一线药物。蛋白酶体抑制剂的主要作用机制是与蛋白酶体结合,抑制蛋白酶体活性,阻止蛋白酶体对细胞内冗余蛋白的降解,最终导致细胞凋亡,主要包括以下三个方面:（1）抑制MM细胞中NF-κB活性及其分泌的活性因子;（2）阻止MM细胞中错误折叠蛋白的清除与降解;（3）稳定肿瘤抑制蛋白阻止细胞进程。p53和IκB的泛素化和降解在MM细胞存活和肿瘤进展中起着重要作用。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体介导的泛素p53和IκB的降解来促进MM细胞的凋亡。尽管蛋白酶体抑制剂已经取得了临床成功,但大多数患者最终都对该疗法产生了抗药性,其潜在机制值得进一步研究。四氢生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin,BH4）是一氧化氮合酶（NOS）、酪氨酸羟化酶、色氨酸羟化酶等的辅助因子,参与一氧化氮和单胺神经递质的生物合成以及疼痛敏感性。近年来,越来越多的研究发现BH4与炎症及肿瘤具有相关性。BH4可通过NOS介导的靶蛋白的S-亚硝化促进肿瘤生长和调节泛素化和蛋白酶体的活性。BH4的缺失会导致细胞中蛋白泛素化和降解增加。然而,BH4在MM耐药和肿瘤进展中的作用仍然未知。因此,本研究将探讨BH4在MM耐药和肿瘤进展中的作用及其机制,以期为MM治疗和克服耐药提供新的策略。研究主要分为以下五部分:第一部分BH4在MM肿瘤进展中的作用目的:探究BH4在MM细胞增殖和肿瘤生长中的作用。方法:（1）用CFSE标记MPC-11和MOPC-315 MM细胞,并通过尾静脉将其注射到Balb/c小鼠中（每只小鼠1×106个细胞）。在种瘤当天（第0天）、第2天和第4天向小鼠腹膜内注射（Intraperitoneal injection,i.p.）BH4（60μg/只）。用PBS处理的小鼠作为对照。第5天,处死小鼠,取肺组织并分离细胞,通过流式细胞术分析MPC-11和MOPC-315 MM细胞的增殖情况。（2）建立MPC-11和MOPC-315荷瘤Balb/c小鼠模型,随机分为两组,分别给予PBS和BH4（从种瘤当天开始,每两天一次,i.p.）,对比肿瘤的生长情况。结果:（1）与PBS组相比,BH4的处理促进了小鼠体内MPC-11和MOPC-315 MM细胞的增殖;（2）与PBS组相比,BH4的处理促进了小鼠皮下MPC-11和MOPC-315肿瘤的生长;结论:BH4在体内环境下促进MM细胞的增殖和肿瘤的生长。第二部分BH4在MM耐药中的作用目的:探究BH4在Bor治疗MM过程中的作用。方法:（1）在体外,用BH4、Bor或它们的组合（BH4+Bor）分别处理MPC-11和MOPC-315细胞,用PBS处理的细胞作对照,通过流式细胞术分析各组细胞凋亡情况;此外,我们也在人MM细胞系（ARP-1和CAG）中进行了同样的处理和分析;（2）建立MPC-11和MOPC-315荷瘤Balb/c小鼠模型,随机分为三组,分别给予PBS、Bor、BH4+Bor（从种瘤第6天开始,每两天经腹腔给药一次）,对比肿瘤的生长情况。结果:（1）在MPC-11和MOPC-315细胞系中,相比PBS组,Bor可以明显诱导MM细胞的凋亡,但添加BH4后几乎完全逆转了Bor的促凋亡作用;在人MM细胞系（ARP-1和CAG）中也有相同的现象;（2）通过MPC-11和MOPC-315荷瘤Balb/c小鼠模型,相比PBS处理组,Bor治疗组肿瘤生长明显被抑制,联合BH4给药后,Bor对肿瘤的抑制作用被明显减弱,在MPC-11和MOPC-315荷瘤Balb/c小鼠模型中都观察到了同样的效果。结论:BH4促进了MM对Bor的耐药。第三部分BH4促进MM细胞存活的分子机制目的:探究BH4促进MM存活的分子机制。方法:（1）用BH4处理MPC-11和MOPC-315细胞24小时后进行转录组测序分析;（2）用BH4,Bor或BH4+Bor处理MPC-11和MOPC-315细胞24小时,通过q PCR检测Usp7和Usp46的m RNA水平;（3）在存在或不存在（PBS）Bor,P22077（USP抑制剂,USPi）,BH4+Bor,Bor+USPi或它们的组合（BH4+Bor+USPi）的条件下培养MPC-11和MOPC-315细胞。通过流式细胞术分析细胞凋亡水平;（4）用si-Usp7、si-Usp46或对照si RNA（si-CT）处理MPC-11,并通过q PCR检测Usp7和Usp46的m RNA水平;（5）在BH4+Bor存在的情况下,用si-Usp7或si-CT处理MPC-11细胞24小时,通过流式细胞术分析细胞凋亡水平;（6）在BH4+Bor存在的情况下,用si-Usp46或si-CT处理MPC-11细胞24小时,通过流式细胞术分析细胞凋亡水平。结果:（1）在MPC-11细胞和MOPC-315细胞中,对比BH4处理组和PBS处理组的RNA测序结果,发现了32个差异基因,其中包括Usp7和Usp46;（2）通过q PCR发现Usp7和Usp46在BH4处理的MPC-11细胞和MOPC-315细胞中表达确实升高,并且相比Bor处理组,BH4+Bor联合处理组Usp7和Usp46表达也明显升高;（3）相比PBS组,USP抑制可以促进MM细胞的凋亡;并且在Bor处理的MM细胞中,USP抑制可以进一步增加Bor诱导的凋亡;在Bor处理的MM细胞中,USP抑制可以部分消除BH4诱导的细胞存活;并且相比BH4+Bor和Bor处理的MM细胞,USP抑制剂的添加也部分抑制了细胞的存活;（4）通过si RNA,在BH4+Bor处理的细胞中敲低Usp7或Usp46后,BH4在MPC-11中介导的Bor耐药作用受到抑制。结论:BH4通过上调USP7和USP46促进了MM细胞的存活。第四部分BH4介导MM细胞存活的信号通路研究目的:探究BH4通过USP7和USP46介导MM细胞存活的信号通路。方法:（1）在添加或不添加BH4,Bor或其组合（BH4+Bor）的情况下,培养MPC-112小时后,通过Western-blots检测p-Ik Bα,Ik Bα和p53的蛋白质水平;相同条件下,培养MPC-11细胞5小时后检测P50和P65的核蛋白水平;（2）MPC-11与USPi,Bor,BH4+Bor或BH4+Bor+USPi培养2小时后检测p Ik Bα,Ik Bα和p53的蛋白质水平;相同条件下,培养MPC-11 5小时后检测P50和P65的核蛋白水平。结果:（1）与PBS组相比,BH4处理组对MM细胞中p53蛋白质水平基本无影响,Bor处理组明显增加了p53的水平,BH4的添加几乎完全逆转了Bor介导的p53水平的升高;同样的,与PBS组相比,BH4对p-IκBα和IκBα的蛋白水平几乎没有影响,对P50和P65的核转运似乎有轻度的增加,Bor处理组明显增加了p-IκBα和IκBα的蛋白水平,减少了P50和P65的核转运,并且在添加BH4之后显著降低了p-IκBα和IκBα的蛋白水平,增加了P50和P65的核转运;（2）在Bor处理的MM细胞中,USP抑制剂部分逆转了BH4介导的p53、p-IκBα和IκBα的减少,以及P50和P65核转运的增加。结论:BH4通过USP7和USP46介导了MM细胞中p53的降解和NF-κB的活化。第五部分USP在MM治疗中的作用目的:探究USP抑制在MM Bor治疗过程中的作用。方法:建立MPC-11和MOPC-315荷瘤Balb/c小鼠模型,随机分为四组,分别给予PBS、Bor、USPi、Bor+USPi,对比肿瘤的生长情况。结果:相比PBS处理组,USPi组肿瘤生长并没有明显被抑制,联合USPi给药后,Bor对肿瘤的抑制作用被明显加强,在MPC-11和MOPC-315荷瘤Balb/c小鼠模型中都观察到了相似的效果。结论:USP抑制促进了Bor在MM中的治疗作用。