论文部分内容阅读
目的:神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）,是临床上最常见的儿童颅外恶性实体肿瘤。根据其临床表现以及肿瘤的生物学特点,NB患者可以被划分为低风险组、中度风险组和高风险组。NB患者的临床表现有明显的异质性,低中风险组患者的治疗效果较好,有些患者甚至可以自发痊愈,长期生存率可达90%以上,而对高风险NB患者即使采用手术、放化疗及干细胞移植多种方式联合治疗,其长期生存率仍低于50%。多数患者在诊断时即为高风险NB,因此高风险组患者是NB治疗的重点,更是治疗的难点。临床发现约有50-60%的高风险组NB患者高表达脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）及/或其特异受体原肌球蛋白相关激酶B（Tropomyosin-related kinase B,Trk B）,这些患者通常预后表现不良。研究发现BDNF/Trk B通过PI3K信号通路和MAPK信号通路引起NB细胞的化疗耐药,但是BDNF/Trk B对NB细胞迁移和侵袭能力的影响和作用机制的研究报道较少,PI3K信号通路和MAPK信号通路是否参与调控BDNF/Trk B对NB细胞迁移和侵袭能力的影响目前未见相关报道,而BDNF/Trk B引起化疗耐药的深入机制也需进一步的研究。本研究的第一部分对BDNF/Trk B在NB细胞的迁移和侵袭及化疗耐药中的作用及机制进行研究。在交感神经系统发育成熟阶段,维持癌基因MYCN的表达能够诱导NB的发生。研究发现在NB患者中大约有20%的患者有MYCN扩增的表现,而在高危患者中有40-50%的患者具有MYCN扩增的表现,这些患者往往预后不良。因此MYCN的相关作用机制是探索治疗高危NB手段的研究方向之一。蛋白精氨酸甲基转移酶1（protein arginine methyltransferase 1,PRMT1）是蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族成员之一,研究发现高表达PRMT1的NB患者无事件生存率明显较低表达患者低。且PRMT1的表达与MYCN的表达有明显相关性,PRMT1能够使MYCN甲基化而发挥作用。本研究第二部分对PRMT1在NB细胞增殖中的作用及机制进行研究。研究方法:本研究第一部分采用受四环素（tetracycline,TET）调节的Trk B表达的TB3和TB8细胞。利用细胞划痕方法及transwell细胞迁移和侵袭方法检测NB细胞的迁移和侵袭情况。Western Blot方法检测P-Akt（Ser473）、P-Erk（Thr202/Tyr204）及P-m TOR（Ser2481）的蛋白表达水平。Western Blot和RT-q PCR方法检测P53及BCL2家族分子的蛋白表达水平和m RNA表达水平。si RNA转染技术来沉默P53或PUMA的表达。慢病毒感染技术来过表达PUMA的水平。MTS方法检测细胞存活及Incucyte变焦活细胞成像系统实时监测细胞融合率。本研究第二部分采用MYCN扩增的BE2C细胞及Kelly细胞;以及受多西环素（Doxycline,Dox）诱导的PRMT1表达沉默的BE2C细胞和Kelly细胞。台盼蓝染色计数细胞及Alamar Blue检测细胞的增殖。Western Blot方法检测PRMT1、PARP及ATF5的蛋白表达水平。病毒感染技术过表达ATF5的水平。Caspase-Glo 3/7Assay检测试剂盒检测Caspase3/7活性。结果:第一部分:1、BDNF/Trk B能够增加NB细胞的迁移和侵袭能力:Trk B表达时,细胞划痕实验结果显示BDNF处理30小时后,细胞的迁移率是93.0%,对照组细胞迁移率为39.2%;transwell细胞迁移实验结果显示BDNF处理组的细胞迁移数是对照组的1.5倍（P＜0.01）;transwell细胞侵袭实验结果显示BDNF处理组的细胞侵袭数是对照组的54倍（P＜0.05）。Trk B不表达时,细胞划痕结果及transwell细胞迁移和侵袭实验结果均显示BDNF对细胞的迁移及侵袭无明显影响（P＞0.05）。2、PI3K信号通路和MAPK信号通路介导BDNF/Trk B引起的NB细胞迁移及侵袭能力的增加:PI3K抑制剂LY294002和MAPK抑制剂PD98059能够分别抑制BDNF/Trk B引起的NB细胞P-Akt（Ser473）和P-Erk（Thr202/Tyr204）表达水平的升高。利用细胞划痕方法检测细胞迁移率:对照组细胞迁移率为54.90%,BDNF处理组细胞迁移率为93.00%,给予LY294002或PD98059预处理分别使细胞的迁移率减少38.10%或30.80%（P值均＜0.01）。Transwell细胞迁移实验结果显示:BDNF处理组细胞的迁移数是对照组的1.67倍（P＜0.01）,LY294002或PD98059均能分别抑制BDNF引起的细胞迁移的增加（P值均＜0.01）。Transwell细胞侵袭实验结果显示:BDNF处理组细胞的侵袭数是对照组的59.50倍（P＜0.01）,LY294002或PD98059均能抑制BDNF引起的TB3细胞侵袭的增加（P值均＜0.01）。3、Akt和m TOR介导BDNF/Trk B引起的NB细胞迁移及侵袭能力的增加:Akt抑制剂Perifosine和m TOR抑制剂Rapamycin能够分别抑制BDNF/Trk B引起的NB细胞P-Akt（Ser473）和P-m TOR（Ser2481）表达水平的升高。利用细胞划痕方法检测细胞迁移率:对照组细胞迁移率为54.90%,BDNF处理组细胞迁移率为85.30%,给予Perifosine或Rapamycin预处理分别使细胞的迁移率减少30.70%或26.00%（P值均＜0.01）。Transwell细胞迁移实验结果显示:BDNF处理组细胞的迁移数是对照组的1.76倍（P＜0.01）,Perifosine或Rapamycin均能分别抑制BDNF引起的TB3细胞迁移的增加（P值均＜0.01）。Transwell细胞侵袭实验结果显示:BDNF处理组细胞的侵袭数是对照组的31.63倍（P＜0.01）,Perifosine或Rapamycin均能抑制BDNF引起的TB3细胞侵袭的增加（P值均＜0.01）。4、BDNF/Trk B抑制Etoposide引起的NB细胞P53表达水平的升高而引起化疗耐药:BDNF预处理能够抑制Etoposide引起的NB细胞P53表达水平的升高。P53 si RNA能够抑制Etoposide引起的P53表达水平的升高。si RNA沉默P53的表达能够降低NB细胞对Etoposide的敏感性:在Etoposide处理后,与对照组比较,转染P53 si RNAs的TB3细胞其存活率增加了17.62%-27.39%（P值均＜0.01）;TB8细胞中,在Etoposide处理后,与对照组比较,转染P53 si RNAs的细胞,其存活率增加了16.40-23.71%（P值均＜0.01）。5、Etoposide或BDNF处理不同时间对BCL2家族分子表达水平的影响:Etoposide处理后,促凋亡分子PUMA、NOXA、BAX和BAK的表达水平均有升高,但以PUMA升高的最明显;抑凋亡分子MCL1的表达水平降低;促凋亡分子BID和抑凋亡分子BCL2及BCL-XL的表达水平无明显变化。BDNF处理后,促凋亡分子PUMA的表达水平降低;抗凋亡分子MCL1和BCL-XL的表达水平升高;促凋亡分子NOXA、BAX、BAK和BID及抗凋亡分子BCL2表达水平无明显变化。6、BDNF/Trk B能够抑制Etoposide或慢病毒感染引起的NB细胞PUMA表达水平的升高而引起化疗耐药:BDNF预处理能够抑制Etoposide引起的NB细胞PUMA表达水平的升高。PUMA si RNA能够抑制Etoposide引起的PUMA表达水平的升高。si RNA沉默PUMA的表达能够降低NB细胞对Etoposide的敏感性:在Etoposide处理后,与对照组比较,转染PUMA si RNAs的TB3细胞其存活率增加了10.33%-22.42%（P值均＜0.01）;TB8细胞中,在Etoposide处理后,与对照组比较,转染PUMA si RNAs的细胞,其存活率增加了9.92-23.46%（P值均＜0.01）。BDNF/Trk B能够抑制慢病毒感染引起的PUMA表达水平的升高。BDNF/Trk B能够抑制PUMA过表达引起的NB细胞死亡:在感染慢病毒72小时后,以对照组存活率为100%,过表达PUMA的TB3细胞的存活率为19.52%（P＜0.01）,给予BDNF处理组细胞存活率升高为45.87%（P＜0.01）;过表达PUMA的TB8细胞的存活率为27.58%（P＜0.01）,给予BDNF处理组细胞存活率升高为56.19%（P＜0.01）。第二部分:1、PRMT1对NB细胞增殖的影响:沉默NB细胞的PRMT1表达,细胞的增殖明显降低:设对照组细胞增殖率为100%,在BE2C细胞中,细胞增殖率分别为33.4%（sh PRMT1#1）和14.8%（sh PRMT1#2）,明显低于对照组（P值均＜0.01）;在Kelly细胞中,细胞增殖率分别为42.8%（sh PRMT1#1）和41.08%（sh PRMT1#2）,明显低于对照组（P值均＜0.01）。抑制剂Decamidine（Dec）能够抑制PRMT1的酶活性,并使NB细胞的增殖明显降低:Alamar Blue检测结果显示BE2C细胞和Kelly细胞的细胞活性随Dec药物浓度增加而降低。2、PRMT1对NB细胞凋亡的影响:沉默NB细胞的PRMT1表达使凋亡分子cleaved-PARP的表达水平及caspase3/7活性（P＜0.01）明显升高。抑制剂Dec能够使凋亡分子cleaved-PARP的表达水平及caspase3/7活性（P＜0.01）明显升高。这些结果提示PRMT1调控NB细胞的增殖和细胞凋亡。3、ATF5参与PRMT1对NB细胞增殖及凋亡的调控:沉默NB细胞的PRMT1表达之后,ATF5的表达水平明显下降。病毒感染过表达ATF5的水平能够阻断PRMT1表达沉默对NB细胞增殖的抑制（P＜0.05）。过表达ATF5的水平能够阻断PRMT1表达沉默诱导的NB细胞凋亡（P＜0.05）。这些结果提示ATF5介导了PRMT1对NB细胞增殖和细胞凋亡的调控。结论:1、BDNF/Trk B能够增加NB细胞的迁移和侵袭能力。PI3K/Akt/m TOR信号通路和MAPK信号通路介导了BDNF/Trk B对NB细胞的迁移与侵袭能力的促进作用。2、P53和PUMA介导BDNF/Trk B引起的NB细胞的化疗耐药。3、PRMT1通过ATF5调控NB细胞的细胞增殖和细胞凋亡。