【摘 要】
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目的：基于重叠延伸PCR （SOE PCR）技术构建转录因子EB （TFEB）丝氨酸114位点突变体原核表达质粒，并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物，以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板，分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增，获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接，以拼接后DNA片段为模板
【机 构】
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济宁医学院精神卫生学院山东省行为医学重点实验室
【基金项目】
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国家自然科学基金青年基金项目（82101340）；
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目的：基于重叠延伸PCR （SOE PCR）技术构建转录因子EB （TFEB）丝氨酸114位点突变体原核表达质粒，并进行体外诱导表达和纯化。方法：根据SOE PCR技术原理设计突变引物，以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板，分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增，获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接，以拼接后DNA片段为模板，采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的 DNA；将其克隆至pGEX-6p-1载体，采用Bam HⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定，DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌（E. coli）中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果：第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段，经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定，连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸（TCT）成功突变为丙氨酸（GCT）。在0.5 mmol·L-1 IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳，纯化后蛋白浓度较高，分子大小正确。结论：利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变，并且TFEB及其突变体基因在E. coli中成功表达。
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