【摘 要】
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根据TGEV的M基因、PEDV的M基因和PoRV的VP2基因序列,通过优化引物、探针浓度和退火温度,确定了最佳的反应体系和扩增程序,成功建立了这3种病毒的TaqMan探针单重荧光定量PCR方
【机 构】
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扬州大学兽医学院,江苏扬州225009;江苏省淮安生物工程高等职业学校,江苏淮安223200;江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏扬州225009;南京农业大学动物医学院,江苏南京21
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根据TGEV的M基因、PEDV的M基因和PoRV的VP2基因序列,通过优化引物、探针浓度和退火温度,确定了最佳的反应体系和扩增程序,成功建立了这3种病毒的TaqMan探针单重荧光定量PCR方法.在此基础上,经过进一步的条件优化,建立了检测TGEV、PEDV、PoRV的三重实时荧光定量PCR方法,该方法对TGEV、PEDV、PoRV的检测灵敏度分别为2.49 copies/μL、4.36 copies/μL、4.96 copies/μL,TGEV、PEDV、PoRV的组内重复试验的CV最大值分别为2.5％、3.8％、4.3％,组间重复性试验的CV最大值分别为3.7％、3.4％、3.2％,均不超过5％,表明建立的方法重复性好;用此方法对PRV、PCV1、PRRSV病毒样本进行检测,均没有交叉反应,表明该方法特异性好;用建立的方法对临床40份病料样品进行了检测,结果显示,TGEV、PEDV、PoRV的阳性检出率分别为5％、30％、12.5％;其中TGEV与PEDV混合感染率为2.5％;PEDV与PoRV混合感染率为5％;多重荧光定量PCR方法与单一荧光RT-PCR方法的检测结果均一致表明建立的方法且有很好的临床府用价值.
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