腐败梭菌(Clostridium septium)是人的气性坏疽以及猪、马、牛、羊、鸡、鹿等多种动物的恶性水肿病的主要病原,产生的α毒素(Clostridium septicum alpha toxin,CSA)是其分泌的几种外毒素中最主要致死性毒力因子和免疫原,具有溶血活性,能够导致机体细胞坏死。腐败梭菌感染羊引起羊快疫,发病羊病程多呈急性经过,发病后迅速死亡,病死率高,给我国畜牧业带来巨大经济损失。疫苗免疫是防治羊快疫的主要手段,由于缺乏体外抗体检测方法。该类疫苗免疫后效果评价多采用血清-毒素中和后经尾静脉注射小鼠,根据小鼠死亡情况判定血清中和抗体效价的方法,该方法操作繁琐,难以用于临床大量样本的免疫效果评价。为此,本研究拟通过制备腐败梭菌α毒素单克隆抗体,建立腐败梭菌α毒素阻断ELISA检测方法,以期用快速、简便、高通量的体外检测方法替代动物检验法,用于疫苗的效力检验及疫苗免疫后效果评价。本研究采用原核表达系统,通过缺失腐败梭菌α毒素的第212~222位共11个氨基酸序列,使其丧失毒力,对腐败梭菌重组α毒素无毒突变体进行体外表达,目的蛋白主要以可溶性形式表达。将表达的蛋白进行纯化,获得浓度为0.76mg/mL的目的蛋白,经Western blot鉴定该重组α毒素蛋白具有良好的反应原性。提取腐败梭菌天然α毒素,制备类毒素后以30 MLD/只小鼠的剂量免疫BALB/c小鼠,经三次基础免疫后测定血清效价,选取效价较高的小鼠进行加强免疫并融合,使用体外表达的重组α毒素蛋白以间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选并对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,最终获得七株强阳性单克隆杂交瘤细胞株,其中374、333、932、443和447五株杂交瘤细胞对腐败梭菌天然α毒素识别能力较强。经亚型鉴定,374、333和932三株为IgG,其余为IgM或IgA,中和试验结果表明仅932株具有中和活性。因此对932株单抗进行腹水制备及辛酸硫酸铵沉淀法纯化,纯化后浓度为3.02mg/mL;经间接ELISA检测,效价可达1:256000。利用获得的单克隆抗体初步建立阻断ELISA检测方法,通过方阵滴定实验对最佳抗原包被条件、最佳封闭方式、最佳抗体作用条件、酶标二抗作用时间、显色液作用时间等分别进行了筛选和优化,确定最佳抗原包被条件为以4μg/mL的浓度在4℃条件下包被12h,最佳封闭方式为5%脱脂乳37℃条件下封闭2h,最佳抗体作用条件为将单抗进行1:512000稀释后37℃孵育45min,酶标二抗作用条件为1:15000倍稀释后37℃孵育45min,显色液作用条件为室温避光显色15min。在确定最佳反应条件后,检测实验室保存的90份经小鼠中和试验验证的阴性羊血清样品,确定该阻断ELISA方法的阴、阳性临界值。重复性试验结果表明,该方法具有良好的批内和批间重复性。阻断ELISA试验与小鼠中和试验和细胞中和试验的相关性测定结果表明,阻断ELISA检测结果与两种中和试验检测结果呈正相关,且阻断ELISA检测方法的敏感性高于中和试验。本研究以腐败梭菌天然α毒素为免疫原,重组表达的α毒素无毒突变体蛋白为筛选抗原,成功制备出1株特异性高、反应性强且具有中和活性的单克隆抗体,在此基础上建立了腐败梭菌α毒素阻断ELISA检测方法,并对其特异性及敏感性进行了验证,有望用于羊快疫灭活疫苗的效力检验及疫苗免疫后效果评价。