多种疾病，包括脑外伤、脑中风、癫痫等，均可导致脑组织缺氧，是引起神经元不可逆死亡的共同病理机制之一。神经元死亡后常导致靶器官功能障碍，导致严重残疾。因此，采取有效措施来补充或替代缺失的神经细胞，恢复对靶器官的支配，促进缺氧性脑损伤后功能恢复，具有重要作用。 研究发现哺乳动物中枢神经系统终身存在神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，主要集中在侧脑室下区(subventricular zone，SVZ)和海马齿状回颗粒下区(subgranularzone，SGZ)。在一定条件下(主要是脑缺氧损伤)这两处的NSCs均表现出增殖、迁移和多方向分化的能力。新生成的神经元可替代丢失的神经细胞，参与损伤修复。显然，利用这种内源性NSCs进行治疗具有无创、无伦理学问题、无免疫排斥等优点，是治疗缺氧性脑损伤的理想途径。 然而，虽然脑缺氧损伤可以激活NSCs原位增殖，但自发条件下NSCs增殖能力有限，更为重要的是，目前对内源性NSCs在缺氧性脑损伤后的增殖机制尚不清楚，这是影响我们通过调控这种内源性．NSCs来修复中枢神经损伤的关键障碍。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在胚胎神经发育和肿瘤发生过程中均发挥了重要的作用。胚胎发育、肿瘤发生过程存在着共性，即处于低氧环境。新近研究发现，Wnt/β-catenin信号通路参与哺乳动物成体神经再生。综上所述，本课题首次提出β-catenin信号通路可能在低氧引发的NSCs增殖过程中具有重要的作用，为此建立了新生绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠海马NSCs和星形胶质细胞体外低氧模型，利用它探讨Wnt/β-catenin信号在低氧条件下NSCs增殖过程中的作用及其机制。 本课题研究包括以下三个部分： 第一部分低氧对新生绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响 本实验通过械分离和无血清培养法获取新生GFP转基因小鼠海马NSCs。体外培养的NSCs呈悬浮生长，传代后可再次形成神经球，目前已稳定传代至15代。神经球经免疫荧光化学染色和免疫细胞组织化学染色鉴定呈Nestin抗原和Musashil抗原阳性，神经球内绝大部分细胞BrdU表达阳性。神经球可被10％胎牛血清诱导分化成神经元(NSE阳性)、星形胶质细胞(GFAP阳性)和少突胶质细胞(MBP阳性)。神经球在增殖和诱导分化过程中GFP稳定表达不丢失。综上表明成功从新生24 h内的GFP转基因小鼠海马组织获取具有自我更新和多向分化潜能的NSCs。利用新生GFP转基因小鼠海马NSCs建立体外低氧(5％O<,2>)模型，探讨低氧对新生小鼠海马NSCs增殖和分化的影响。结果发现，低氧条件下，NSCs克隆形成率，BrdU阳性细胞率和MTT值均高于常氧条件(P<0.05)。NSCs诱导分化为神经元和星形胶质细胞的数量与常氧条件相比，分比增加了31.06％和19.79％(P<0.05)。表明低于传统培养的低氧条件，可以促进新生小鼠海马NSCs的体外增殖，增加分化细胞尤其是神经元的数量。 第二部分Beta-catenin信号在低氧条件下海马NSCs增殖中的作用 本实验首先通过RT-PCR法检测到体外培养的海马NSCs表达Wnt/β-catenin信号通路的主要分子，包括Wnt膜受体(Frz1)，β-catenin，Axinl，GSK-3β和LEF1，表明海马NSCs具备对Wnt信号反应的能力。荧光素酶活性检测法检测发现低氧条件，海马NSCs内荧光素酶活性明显提高，间接表明低氧增加细胞内β-catenin的含量。通过Western Blotting法进一步检测发现，低氧培养NSCs 12h和24h后，胞浆和胞核中β-catenin均有所增加，尤以胞核增加明显(P<0.05)。结果还发现，Wnt/β-catenin的靶基因cyclinD1表达也增高(P<0.05)。 依据上述结果，我们推断β-catenin信号可能参与低氧条件下海马NSCs增殖。因此采用电穿孔的方法分别增加和抑制NSCs内β-catenin的表达，通过MTT法检测NSCs增殖情况，Western Blotting法检测β-catenin下游的靶基因cyclinD1的表达情况。结果发现，增加NSCs内β-catenin的表达，可以进一步促进低氧条件下NSCs的增殖和cyclinD1的表达(P<0.05)；抑制NSCs内β-catenin的表达，降低低氧条件下NSCs的增殖和cyclinD1的表达(P<0.05)，但仍高于常氧N(P<0.05)。表明β-catenin信号通过调节cyclinD1的表达参与低氧引起的NSCs的增殖过程。 第三部分低氧增加海马NSCs内β-catenin表达的机制 低氧增加NSCs内β-catenin含量的机制尚不明确。研究表明，Wnt3和Wnt3a蛋白对胚胎海马发育和成体海马神经再生具有重要的作用。星形胶质细胞不仅是脑内主要的支持细胞，而且还通过分泌一些因子(如Wnt3)参与其他细胞的调控。因此本实验首先探讨低氧培养是否具备上调海马星形胶质细胞内Wnt3，Wnt3α的作用。通过RT-PCR法检测低氧条件下新生小鼠海马星形胶质细胞内Wnt3，Wnt3α的表达变化， 结果发现，常氧培养的海马星形胶质细胞内存在Wnt3的表达，低氧下调Wnt3的表达(P<0.05)；而常氧和低氧条件培养的海马星形胶质细胞内均未不表达wnt3a。研究表明，丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶AKT激活后，通过磷酸化糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的Ser 9残基抑制其活性，进而增加β-catenin积聚。本研究通过Western Blotting检测发现，低氧上调海马NSCs内Akt蛋白和GSK-3β蛋白的磷酸化水平(P<0.05)。结果提示低氧增加β-catenin的含量与与海马星形胶质细胞分泌的Wnt3，Wnt3a无关，与低氧促进海马NSCs内Akt蛋白和GSK-3β蛋白的磷酸化有关。 综上所述，低氧促进体外新生GFP转基因小鼠海马NSCs增殖和分化，β-catenin信号通过调节cyclinD1的表达参与低氧条件下海马NSCs的增殖过程，β-catenin的作用发挥与海马星形胶质细胞分泌的wnt3，Wnt3a无关，与低氧促进NSCs内Akt蛋白和GSK-3β蛋白的磷酸化有关。本研究对于通过调控内源性NSCs增殖来促进中枢神经损伤后的修复具有重要的意义。