【摘 要】
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背景:组织工程和再生医学等前沿技术的发展为组织工程骨治疗临床骨缺损提供了新的思路,骨替代材料负载生长因子和细胞的受控递送可以增强和加速功能性骨形成。其中,转化生长因子β1（TGFβ1）和血管内皮生长因子（VEGFA）在骨生长,发育和愈合中扮演重要角色。在此,我们旨在通过CRISPRa系统共激活种子细胞TGFβ1和VEGFA基因,调控种子细胞成骨分化及血管生成潜能。并制备可注射水凝胶支架材料联合种子
【基金项目】
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广东省自然科学基金课题（2016A030313554）；
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背景:组织工程和再生医学等前沿技术的发展为组织工程骨治疗临床骨缺损提供了新的思路,骨替代材料负载生长因子和细胞的受控递送可以增强和加速功能性骨形成。其中,转化生长因子β1（TGFβ1）和血管内皮生长因子（VEGFA）在骨生长,发育和愈合中扮演重要角色。在此,我们旨在通过CRISPRa系统共激活种子细胞TGFβ1和VEGFA基因,调控种子细胞成骨分化及血管生成潜能。并制备可注射水凝胶支架材料联合种子细胞促进材料植入后血管化和成骨能力。同时,探讨基因编辑种子细胞对血管化及成骨作用的影响和机制。目的:本文旨在通过CRISPRa系统共激活种子细胞TGFβ1和VEGFA基因,研究基因编辑种子细胞对成骨及成血管基因、蛋白和细胞染色等方面影响。同时,通过制备新型可注射水凝胶材料联合基因编辑种子细胞,探讨其体内植入后对骨缺损修复过程中血管化及成骨作用的影响机制。方法:1、化学方法合成对质粒具有高转染效率、可生物降解的聚天冬氨酸（细胞微管和细胞核定位信号融合肽-二甲基组氨酸）pAsp（MTAS-NLS-co-DMH）聚氨基酸载体并表征验证。2、pAsp（MTAS-NLS-co-DMH）载体转染细胞有效性鉴定:应用激光共聚焦和流式定量分析检测载体转染eGFP质粒到MC3T3-E1细胞内的情况,并筛选最佳转染N/P 比。3、构建TGFβ1和VEGFA的sg-RNA质粒表达载体,筛选最佳表达序列和表达条件。4、实时定量PCR检测转染dcas9质粒及TGFβ1/VEGFA的sg-RNA质粒对TGFβ1/VEGFA基因和成骨分化相关基因表达情况影响,同时采用Western blot实验、Elisa实验进一步验证。5、化学方法制备双交联水凝胶,并进行表征和检测,MTT法检测细胞毒性。6、Micro-CT检测材料植入体内新生骨形成结果,HE染色,Masson染色,OCN、CD31组化染色,分析新骨、胶原及血管形成情况。结果:1、核磁表征验证成功合成pAsp（MTAS-NLS-co-DMH）质粒转染载体。2、eGFP质粒转染后eGFP表达证明了载体构建的有效性,根据流式和共聚焦结果,筛选出N/P≥10:1为最佳转染比值。3、TGFβ1/VEGFA的sg-RNA重组质粒测序验证正确,并筛选出最佳序列和表达条件。4、TGFβ1/VEGFA共转染组在RNA水平TGFβ1和VEGFA表达均显著高于对照组,Western blot检测胞内TGFβ1蛋白明显高于对照组,VEGFA蛋白表达无明显差异。Elisa检测胞外TGFβ1蛋白表达无明显差异,VEGFA蛋白明显增加。5、红外光谱表征成功制备双交联水凝胶,不同浓度的水凝胶对细胞无毒性。6、Micro-CT结果显示:TGFβ1/VEGFA共转染组在4w、8w时新骨形成面积、体积及新生骨密度显著高于各对照组。HE染色、OCN染色、Masson染色证实新骨形成情况同Micro-CT结果,CD31检测提示共转染组新生血管数量显著高于其余各组。结论:成功合成对质粒具有高转染效率的pAsp（MTAS-NLS-co-DMH）载体,利用TGFβ1/VEGFA 的 sg-RNA 表达载体过表达 MC3T3-E1 细胞 TGFβ1 和 VEGFA基因,可同时协同促进多种成骨相关因子表达,细胞水凝胶支架植入体内后可有效促进骨缺损修复,TGFβ1/VEGFA基因编辑可修饰理想的高效成骨种子细胞。
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