研究背景:多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种致命性恶性浆细胞肿瘤,占血液肿瘤的10%。MM的骨髓微环境是缺氧的,缺氧诱导因子1α（HIF-1α）增强新生血管,促进糖代谢异常,诱导抗凋亡蛋白的表达。DKK1与骨髓瘤在内的多种恶性肿瘤骨转移、骨破坏密切相关。目前缺氧调控DKK1的表达机制尚未有报道。目的:1.MM患者DKK1的高表达与骨髓微环境的缺氧的关系;MM细胞的快速增殖所导致的缺氧,同时也是促进DKK1的重要因素;2.缺氧导致MM细胞中的HIF-1a及CREB的活化,与MMSET协同可能是发挥组蛋白修饰和调控DKK1表达的关键因子;3.同时阻断缺氧和CREB可能具有比单独靶向DKK1更显著的逆转骨破坏的作用。方法:1.缺氧骨髓瘤细胞的诱导和RNA-seq测序:MM.1S细胞和LP-1细胞缺氧诱导24小时后,用转录组m RNA-seq测序分析差异表达明显的基因。在缺氧（1%O2）条件下分别培养细胞6、12、24小时,用q PCR和WB检测DKK1水平变化情况。通过酶联免疫吸附ELISA试验显示常氧和缺氧条件下,培养液中分泌的DKK1水平。2.细胞学现象研究:用Western blot检测在低氧条件下培养达24小时后的MM.1S和LP-1细胞中缺氧相关信号通路蛋白marker变化,检测AKT和p38激酶的磷酸化变化情况。使用p38抑制剂SB203580处理细胞24小时,或构建sh RNA敲低细胞内p38α基因,DKK1 m RNA的表达水平明显降低。用细胞免疫荧光实验检测缺氧差异表达异常明显的转录因子CREB蛋白的核转位情况,同时用WB检测蛋白的磷酸化水平。用慢病毒介导MM细胞中过表达CREB和MMSET蛋白,用q PCR和WB检测DKK1的表达情况。用荧光素酶分析显示,在CREB过度表达增加的情况下,p GL3-DKK1-luc报告子的活性。缺氧24小时用WB检测组蛋白甲基化酶MMSET的表达变化情况。用缺氧诱导因子HIF-1α抑制剂（LW6）处理MM细胞后,检测MMSET在缺氧诱导下的逆转情况。3.临床资料的收集和指标检测:收集临床确诊的骨髓瘤患者50例患者骨髓和16例t（4;14）突变的患者骨髓标本,5例健康人骨髓标本。收集于重庆医科大学附属永川医院血液内科,本实验研究目的和研究步骤告知受试者和家属。回顾分析患者年龄,血液中M-protein水平、患者病情和服药的情况。经伦理委员会批准。使用免疫组化（IHC）检测骨髓组织切片中的DKK1和MMSET表达水平,独立实验的单因素方差分析确定p值,用ELISA检测骨髓血清中DKK1的水平,p值由皮尔逊系数确定。4.细胞学机制研究:免疫共沉淀实验（Co-IP）确定CREB和MMSET两种蛋白存在直接相互作用关系。构建MMSET不同截短体（ΔPWWP1、ΔPHD、ΔSET）和CREB免疫共沉淀确定相两者相互作用的蛋白结构域,构建CREB持续磷酸化的突变体Co-IP检测CREB和MMSET相互作用变化情况。构建MMSET突变（ΔSET、甲基化酶功能缺失Y1179A）,用荧光素酶分析显示,在CREB过度表达增加的情况下,p GL3-DKK1-luc报告子的活性。用慢病毒包装质粒感染MM细胞,用CHX检测MMSET突变体对CREB蛋白体外稳定性的变化情况。CHIP-q PCR验证缺氧24小时后CREB、MMSET和H3K36me2在DKK1启动子的富集作用。进一步用HIF-1α抑制剂LW6或CREB抑制剂KG-501回复实验验证。5.靶向CREB诱导DKK1骨破坏的细胞和裸鼠移植瘤体内实验;构建sh CREB细胞经缺氧培养24小时后,将上清液与MSC细胞共培养,经茜素红-s染色强度和碱性磷酸酶（ALP）的活性检测MSC细胞成骨能力。股骨腔内注射BTZ耐药的骨髓瘤细胞,构建8只NOD-scid IL2Rgnull（NSG）骨髓瘤小鼠模型,将低氧激活的前体药物（TH-302）和CREB抑制剂（KG-501）单独或联合使用处理小鼠,用Micro-CT扫描检测小鼠股骨干骺端骨小梁数目、骨小梁厚度。结果:1.MM.1S细胞和LP-1细胞缺氧诱导24小时后,用转录组m RNA-seq测序分析差异表达明显的基因,MM.1S细胞中鉴定了1536个不同表达的基因,在LP-1细胞中鉴定了987个基因,在这两个细胞系之间重叠的58个基因中有47个基因显著增加。其中,与骨髓瘤进展和骨病变密切相关的DKK1、ATP结合盒亚家族G成员2（ABCG2）、核受体结合SET结构域蛋白2（NSD2）和BCL2凋亡调节因子（BCL2）表达升高显著,激活转录因子3（ATF3）、MAX1、二聚化蛋白（MXI1）和锡钙蛋白2（STC2）是缺氧诱导因子（HIF）-1α信号通路的已知靶点。根据KEGG分析,p38-MAKP信号通路激活明显,酶联免疫吸附试验（ELISA）也证实缺氧促进DKK1分泌到培养基中。2.骨髓瘤细胞在缺氧培养24小时后,P38激酶明显激活,抑制p38的表达可以降低缺氧诱导的DKK1表达。缺氧增加Ser133的CREB磷酸化,同时增加CREB蛋白核内转移。用CREB抑制剂KG501处理细胞,抑制由缺氧诱导的DKK1表达。CREB过表达刺激DKK1荧光素酶报告基因的转录活性。低氧诱导MMSET表达,使用HIF-1α抑制剂LW6,可以逆转这种效果。3.临床患者骨髓活检样本的免疫组织化学分析同一标本中MMSET和DKK1水平之间正相关。t（4:14）阳性患者骨髓血清MMSET表达异常升高,与其他染色质异常患者相比,骨髓瘤细胞中DKK1和MMSET表达之间有很强的正相关（r2=0.4926 p=0.0004）。4.在HEK293T细胞中过表达HA-CREB和FLAG-MMSET蛋白,外源性蛋白免疫共沉淀Co-IP实验结果显示,同时针对MM细胞内CREB和MMSET蛋白的Co-IP实验结果,CREB和MMSET蛋白有直接相互作用情况。细胞免疫荧光实验显示两者有细胞核内共定位。构建的MMSET不同截短体和CREB免疫共沉淀结果显示,全长MMSET蛋白和没有缺失PHD结构域的MMSET蛋白能和CREB蛋白相互作用。在敲低MMSET的细胞中,CREB蛋白半衰期显著下降,蛋白不稳定性增加。在MM细胞中过表达MMSET突变体（ΔSET、甲基化酶功能缺失Y1179A）,CREB蛋白稳定性降低。荧光素酶检测实验结果显示长链MMSET激活DKK1启动子活性是ΔSET和Y1179A的8倍。用WB检测发现缺氧增加了骨髓瘤细胞中H3K36me2水平。同时用染色质免疫沉淀（Ch IP）分析发现缺氧使CREB、MMSET、H3K36me2在DKK1启动子上的富集增加。Ch IP实验检测发现使用缺氧诱导因子HIF-1α抑制剂LW6、p38抑制剂SB203580或CREB抑制剂KG-501用消除了缺氧诱导的H3K36me2在DKK1启动子富集水平增加。5.敲低细胞内CREB,用WB检测DKK1表达明显降低,用CHX检测MMSET蛋白稳定性不变。sh CREB慢病毒感染MM细胞后缺氧培养后收集细胞上清液和间充质干细胞共培养,茜素红-S染色和碱性磷酸酶染色发现成骨活性增强。6.NSG/SCID小鼠股骨腔内注射BTZ耐药的MM.1S（5×105个/只）细胞,单独或者联合注射TH-302（20 mg/kg）、KG-501（10 mg/kg）药物,micro CT和骨结构定量分析检测发现骨小梁和骨破坏在联合用药回复最明显。结论:研究结果表明,缺氧通过p38-MAPK-CREB信号轴,并且协同组蛋白甲基化酶MMSET异常调节了骨髓瘤细胞中DKK1的表达,同时揭示靶向阻断CREB可以抑制DKK1的表达,抑制耐药骨髓瘤细胞的生长和增殖,抑制破骨。为MM的治疗策略的发展提供了新的理论基础。