【摘 要】
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番茄是重要的蔬果作物,而大豆是重要的蔬油兼用作物,也是人类和牲畜的优质蛋白来源。然而,番茄和大豆生产中极易感染各种植物病毒,并造成巨大的产量和经济损失。凤果花叶病毒（pepino mosaic virus,PepMV）和苜蓿花叶病毒（alfalfa mosaic virus,AMV）分别是世界范围内番茄和大豆作物的重要病毒病原,严重威胁着番茄和大豆安全生产。迄今作物病毒病缺乏有效的防治药剂,而简单
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番茄是重要的蔬果作物,而大豆是重要的蔬油兼用作物,也是人类和牲畜的优质蛋白来源。然而,番茄和大豆生产中极易感染各种植物病毒,并造成巨大的产量和经济损失。凤果花叶病毒（pepino mosaic virus,PepMV）和苜蓿花叶病毒（alfalfa mosaic virus,AMV）分别是世界范围内番茄和大豆作物的重要病毒病原,严重威胁着番茄和大豆安全生产。迄今作物病毒病缺乏有效的防治药剂,而简单快速、灵敏特异、准确实用的检测技术是病毒病监测、预警和开展绿色防控的关键。为此,本研究分别创制了抗PepMV和抗AMV的特异、灵敏的单克隆抗体,并以创制的单克隆抗体为检测抗体建立了检测这两种病毒的灵敏和特异的血清学方法,为PepMV和AMV的诊断检测、流行病学研究以及科学防控提供试剂和技术支持。1.凤果花叶病毒单克隆抗体的创制及其血清学检测方法用差速离心的方法从感染PepMV的本氏烟中提取了PepMV粒子,病毒粒子作为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,利用鼠杂交瘤细胞技术创制分泌抗PepMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过免疫鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合、PepMV抗体选择和细胞克隆,获得6株分泌高度特异和高度灵敏的PepMV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,即15B2、8H6、23D11、20D9、3A6和8E3。这些杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体类型均为IgG1、kappa轻链,间接ELISA效价均达到10-7。Western blot实验分析发现,6个PepMV单克隆抗体均特异性识别PepMV的衣壳蛋白。ACP-ELISA结果显示,6个单克隆抗体均与PepMV发生特异性免疫反应,而不与番茄黄曲叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、番茄花叶病毒、番茄斑萎病毒、马铃薯X病毒和健康植物发生交叉反应。以创制的单克隆抗体为检测抗体建立了检测番茄植株中PepMV的ACP-ELISA、dot-ELISA、Tissue print-ELISA和DAS-ELISA四种血清学方法。建立的ACP-ELISA、dot-ELISA和DAS-ELISA方法检测病叶粗提液的灵敏度分别达1:163,840、1:20,480和1:1,310,720倍稀释（重量/体积,g/m L）。利用建立的血清学方法对田间样本中的PepMV进行了检测分析,并用RT-PCR和DNA测序验证了4种血清学方法检测PepMV的可靠性和有效性。2.苜蓿花叶病毒单克隆抗体的创制及其血清学检测方法用差速离心的方法从感染AMV的大豆植株中提取了AMV粒子,以提纯的病毒粒子作为免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,利用鼠杂交瘤细胞技术创制了5株分泌AMV的高度特异和灵敏的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,即22G7、7G12、13G1、21D5和22D2。5个杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的间接ELISA效价均达到10-7。Western blot实验结果发现,5株单克隆抗体特异性地识别AMV的外壳蛋白。ACP-ELISA分析发现,5个单克隆抗体均与AMV发生特异性免疫反应,而不与大豆花叶病毒、大豆矮化病毒、黄瓜花叶病毒、李属坏死环斑病毒、苹果坏死花叶病毒和健康植物发生交叉反应。以创制单克隆抗体为检测抗体建立了检测大豆中AMV的ACP-ELISA、dot-ELISA和Tissue print-ELISA三种血清学方法。建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测病叶粗提液的灵敏度分别达1:81,920和1:20,480倍稀释（重量/体积,g/m L）。利用建立的血清学方法对田间大豆样本中的AMV进行了检测分析,并用RT-PCR和DNA测序验证了三种血清学方法检测AMV的准确性和有效性。
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