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背景与目的：
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)作为神经营养因子家族的成员之一,具有营养神经元、保护和修复受损神经等生物学效应,可以调节神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的发育过程,具有治疗缺血性脑血管病的潜能。但由于血脑屏障(blood-brain-barrier,BBB)的限制,外周给药方法难以将其运入脑内。新近的研究发现,经鼻给药可以绕过BBB,将NGF相对有效地送至中枢神经系统(central nervous system,CNS),但是这种给药方式同样面临着生物利用度较低的问题。
另一方面,针刺作为治疗脑梗死的常用有效方法之一,常与药物疗法联用表现出协同效应。其中,人中和百会为治疗脑梗死的常用穴位。根据经络理论,人中、百会所在之督脉入属于脑,而解剖学上,经鼻通路和督脉均位于人体正中线上。那么,经鼻通路和督脉之间是否存在某种联系?此外,有研究报道针灸某些穴位可以诱导NGF受体trkA的表达。因此,NGF经鼻给药和电针人中、百会联用对脑梗死的疗效值得进一步探讨。
本研究首先探讨经鼻给予NGF能否促进大鼠大脑中动脉阻塞(middlecerebral artery occlusion,MCAO)术后的神经发生;其次观察电针人中和百会是否可以促进NGF经鼻给药后向CNS的转运;评估电针人中和百会对大鼠MCAO术后trkA表达的影响;最后评价NGF经鼻给药与电针联用对脑缺血损伤的治疗作用。
方法：
成年雄性SD大鼠MCAO术后第2-6 d分别经鼻给予100μl媒介液或NGF(0.6 mg/ml),采用5-溴脱氧尿苷嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记NSCs,并于术后第8、35 d处死大鼠。行免疫组化观察术后第8和35 d缺血侧SVZ和纹状体的BrdU阳性细胞,利用激光共聚焦技术观察术后35 d纹状体BrdU和NeuN(neuronal nuclear antigen)或GFAP(glial fibrillary acid protein)的双标情况。
采用125I标记NGF,行MCAO术后的大鼠随机分为125I-NGF经鼻给药组(对照组)、电针人中和百会与125I-NGF经鼻给药联用组(EA组)和假电针与125I-NGF经鼻给药联用组(PEA组),单次给药后0.5、1、2、6 h处死大鼠。分别留取脑组织、上颈髓、双侧三叉神经和外周组织,称重后采用γ自动计数仪测定各组织中125I-NGF的放射性计数。
为评估电针人中、百会对大鼠脑缺血后trkA表达的影响,大鼠行MCAO术后2h起给予每日1次电针,于术后24、48和72h处死大鼠,行免疫组化观察术后72 h后梗死灶周围trkA阳性细胞的数量,利用western blot检测术后24、48和72 h梗死灶周围trkA蛋白的表达。
为评价NGF经鼻给药和电针人中、百会联用对急性脑梗死大鼠的治疗作用,行MCAO术的大鼠随机分为对照组、电针组、NGF经鼻给药组以及NGF经鼻给药和电针联用组,分别于术后每天进行神经功能评分;于MCAO术后24 h进行TUNEL染色测定脑梗死灶周围凋亡细胞的数目。
结果：
MCAO术后第8 d,经鼻给予NGF对SVZ和纹状体的BrdU阳性细胞无显著影响。而在术后第35 d,NGF显著增加了SVZ和纹状体的BrdU阳性细胞,提高了NSCs的存活率。免疫荧光结果显示,NGF增加了纹状体BrdU+NeuN+细胞,而两组间BrdU+GFAP+细胞数量无统计学差异。
经鼻给药30 min后,电针人中、百会显著提高了嗅球、皮层、纹状体、丘脑、海马的125I-NGF的放射性浓度;1 h后脑干和小脑的NGF浓度也得到显著提高;2 h后各部位浓度有所下降;6 h后脑组织各区中的NGF浓度降至对照组水平。而假电针在各个时间点对各个脑区的NGF浓度均无显著影响。
免疫组化结果显示,电针对大鼠MCAO术后72 h梗死灶周围trkA阳性细胞的数量无显著影响。Western blot结果表明,电针组大鼠梗死灶周围trkA蛋白的表达在术后24、48、72 h各个时间点与对照组相比均无显著变化。
TIYNEL染色结果表明,NGF经鼻给药或与电针联用均可降低脑梗死灶周围的细胞凋亡,其中联用效果更为显著。但MCAO术后第2 d起,仅经鼻给予NGF和电针联用组的大鼠神经功能评分改善显著,而其它组与对照组相比均无统计学差异。
结论：
本研究结果表明,NGF经鼻给药对脑缺血后大鼠SVZ的NSCs增殖无明显影响,但可提高SVZ和纹状体NSCs的存活率,并促进其向神经元方向分化。电针人中、百会可以促进NGF经鼻给药后经嗅粘膜通路向CNS的转运,对急性脑梗死大鼠脑梗死灶周围的NGF受体trkA无明显影响。NGF经鼻给药和电针联用可以有效减少细胞凋亡,促进短期内神经功能的改善,为脑缺血的治疗提供了一条新思路。