论文部分内容阅读
低温等离子体（nonthermal plasma,NTP）作为一项新兴的非热杀菌技术,具有高效、广谱、绿色等优点,已成为国内外食品杀菌领域的研究热点。尽管NTP具有较强的杀菌效果,并克服了传统杀菌技术的一些不足,但根据文献报道以及实验室前期研究结果发现在NTP杀菌不彻底时,其激发产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）等活性粒子,可诱导微生物进入活的不可培养（viable but nonculturable,VBNC）状态。由于处于VBNC状态的微生物无法在培养基上形成可见菌落,能够逃避常规检测而造成假阴性结果,且其仍具有代谢活性,在适宜条件下可复苏再生长,是危害食品安全的“隐性污染源”。针对上述低温等离子体杀菌处理中存在的潜在风险,本论文以食源性金黄色葡萄球菌作为研究对象,采用分子生物学、转录组学、蛋白组学和生物信息学等相结合的技术手段系统开展了低温等离子体诱导产生VBNC状态金黄色葡萄球菌的分子机制及其潜在危害性的研究,为优化低温等离子体杀菌工艺、避免VBNC状态微生物的形成奠定理论基础,有助于保障低温等离子体加工食品的安全性。主要研究内容和结果如下:（1）低温等离子体对VBNC状态金黄色葡萄球菌的诱导规律建立并优化叠氮溴化丙锭联合定量聚合酶链式反应法（PMA-q PCR）对金黄色葡萄球菌总活菌数进行定量分析,结果显示PMA最佳处理浓度为50μM,PMA-q PCR法最低检测限为220 CFU/m L。采用PMA-q PCR法结合平板计数法监测不同强度低温等离子体处理后,4oC贮藏条件下不同状态金黄色葡萄球菌菌数的变化情况,结果显示随着贮藏时间延长,金黄色葡萄球菌总活菌数没有显著变化,可培养状态菌数逐渐降低,而VBNC状态菌数逐渐增加;且随着等离子体所施加能量从8.1 k J增加至24.3 k J时,金黄色葡萄球菌完全进入VBNC状态所需时间从80 h缩短至16 h。进一步采用最可能数法（most probable number,MPN）考察不同因素对VBNC状态金黄色葡萄球菌复苏情况的影响,结果显示VBNC状态金黄色葡萄球菌复苏前延滞期和复苏水平都与复苏温度成反比,当复苏温度从15oC增加37oC,VBNC状态金黄色葡萄球菌复苏前延滞期从66 h减少至10 h,复苏水平从3.46 log10MPN/m L降低至2.01 log10MPN/m L,而VBNC状态金黄色葡萄球菌的复苏与所添加化学物质（葡萄糖、丙酮酸钠和吐温80）无关。处于不同VBNC状态时期的金黄色葡萄球菌具有不同的复苏能力,随着金黄色葡萄球菌处于VBNC状态的时间越久,其复苏前延滞期越长,可实现复苏的细菌数量越低,所具有的复苏能力越弱。（2）VBNC状态金黄色葡萄球菌的生物学特征应用荧光素酶-荧光素、29,79-双-（2-羧乙基）-5-（-6）-羧基荧光素（BCECF-AM）探针等分子生物学手段,考察了VBNC状态金黄色葡萄球菌的生理特性,结果显示与可培养状态金黄色葡萄球菌相比,VBNC状态金黄色葡萄球菌胞内ATP水平和p H显著降低,胞内7种代谢酶（类脂酶C14、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、白氨酸芳胺酶、β-半乳糖酶、!-葡萄糖酶、β-葡萄糖酶）的活性发生下降,但5种代谢酶（碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、类脂酯酶C8、酯酶C4、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶）的活性未发生变化。进一步利用气相色谱测定细菌细胞膜中的脂肪酸组成,结果显示金黄色葡萄球菌进入VBNC状态后,其细胞膜中反异构型支链脂肪酸含量从47.33±0.19%增加至54.35±0.30%,而饱和脂肪酸和长链脂肪酸（C18:0、C19:0、C20:0）比例发生显著下降,说明细胞膜的流动性趋向增强。采用透射电镜、扫描电镜和原子力显微镜观察和分析细菌结构与尺寸变化,结果显示与可培养状态金黄色葡萄球菌相比,VBNC状态金黄色葡萄球菌外部被一层聚合物所黏附,细胞表面变得粗糙,细胞间发生团聚,细胞平均体积减小约19.6%。（3）低温等离子体对VBNC状态金黄色葡萄球菌的诱导机制通过考察低温等离子体处理前后金黄色葡萄球菌胞内外氧化基团水平与胞内ATP浓度变化情况,发现了低温等离子体所产生的氧化效应是导致金黄色葡萄球菌胞内ATP水平发生损耗的主要因素。采用RNA-seq转录组测序技术结合KEGG通路注释,对差异基因进行定性、定量和功能分析,解析了VBNC状态金黄色葡萄球菌代谢、基因信息和环境信息处理相关通路的调控情况,进一步利用氧化磷酸化解偶联剂-羟基氰氯苯腙降低细菌胞内ATP水平,验证了ATP损耗在VBNC状态形成中的关键作用,从而初步揭示低温等离子体对VBNC状态金黄色葡萄球菌的诱导机制:低温等离子体对金黄色葡萄球菌产生氧化胁迫,促进其启动系列氧化应激反应,产生胞内ROS降解酶、促进Dps蛋白介导DNA保护通路及激活Msr与Trx蛋白损伤修复系统,大量应激蛋白的合成造成胞内ATP水平发生损耗,致使细菌通过抑制肽聚糖和脂肪酸合成、基因复制、转录翻译、信号转导等能量依赖性过程来降低能耗,抑制细菌代谢、生长、分裂等活动,从而导致细菌进入VBNC休眠状态。（4）VBNC状态金黄色葡萄球菌的抗性和毒力特性系统考察了VBNC状态金黄色葡萄球菌对外界胁迫的耐受性及其毒力特性的变化情况。在抗性方面,相较于可培养状态金黄色葡萄球菌,VBNC状态金黄色葡萄球菌对热、酸和渗透压的抗性没有显著变化,而对氧化胁迫（过氧化氢）的耐受性显著增加,推测与其氧化应激响应基因表达上调有关。此外,金黄色葡萄球菌进入VBNC状态后,对苯唑西林、环丙沙星、氯霉素和甲氧苄氨嘧啶的耐受性显著增强,推测与其抗生素外排泵Mep A和Nor B的开放、胞内ATP水平削减等相关。在毒力特性方面,采用i TRAQ联合HPLC-MS/MS技术定量分析毒力因子的表达情况,结果显示VBNC状态金黄色葡萄球菌中大部分毒力因子（毒素、外源酶等）的表达受到显著抑制,但Sdr D、Clf B、Sas H与SCIN所介导的黏附侵染通路被激活,仍能保证VBNC状态金黄色葡萄球菌具备感染宿主细胞的能力。此外,VBNC状态金黄色葡萄球菌显著下调表面病原相关分子模式（如肽聚糖、磷壁酸、脂蛋白）的合成水平,规避宿主模式识别受体的识别作用,降低宿主的免疫反应,同时VBNC状态金黄色葡萄球菌显著提高胞外荚膜的合成水平,可为菌体表面分子提供物理性屏障,从而保护细菌免受宿主的识别。