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Apelin/APJ系统广泛,参与血管生长、内环境稳态和能量代谢等生物学功能过程。Apelin-13作为apelin的主要活性肽,是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体,参与调控心血管系统的生理或病理进程。动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是心脑系统疾病和外周血管疾病最主要的病理基础之一。血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）异常增殖是AS发生发展中的重要环节,且DNA损伤、线粒体功能紊乱以及自噬异常加剧AS病理进程。课题组前期研究发现apelin-13通过促进活性氧（Reactive oxygen species,ROS）生成,诱导VSMCs增殖。因此,进一步深入研究apelin/APJ系统在AS发生、发展的调控机制,将对AS的防治具有重要意义。生理状态下,细胞内的过氧化物酶自噬稳定在一个较低的水平,其功能为清除受损的过氧化物酶体,维持细胞内氧化代谢水平。当细胞受到应激、缺氧等外界刺激时,异常过氧化物酶体水平显著增加,诱导自噬过度激活,最终引起机体出现一系列病理变化。过氧化物酶体发生因子5（Peroxisomal biogenesis factor 5,PEX5）,是过氧化物酶体自噬的受体蛋白,主要参与过氧化物酶体自噬调控。生物信息学分析发现,apelin和PEX5可能存在蛋白之间相互作用。文献表明PEX5可被蛋白激酶磷酸化进而启动过氧化物酶体自噬。推测apelin可能诱导PEX5磷酸化修饰增强过氧化物酶体自噬的发生。但apelin-13诱导PEX5磷酸化修饰的具体机制仍不明确,其中所涉及的细胞信号转导通路需进一步探究。丝裂原活化蛋白激酶15（Mitogen-activated protein kinases 15,MAPK15）是磷酸化激酶,它的激活水平受泛素蛋白体系途径严格控制。生物信息学分析表明,MAPK15可能参与PEX5磷酸化修饰,其磷酸化修饰位点为589位丝氨酸。蛋白质类泛素化修饰是一种蛋白翻译后修饰过程,它可以共价修饰个别氨基酸残基,使其理化性质、构象发生改变,进而影响蛋白功能。泛素样蛋白3（Ubiquitin-like protein 3,UBL3）是一种小分子类泛素化蛋白,文献报道MAPKs可以与UBL3存在融合。生物信息学软件分析发现MAPK15的42位赖氨酸可能是类泛素化修饰的重要位点,提示UBL3对MAPK15可能存在类泛素化修饰。因此,本课题提出“Apelin-13通过UBL3类泛素化修饰MAPK15诱导PEX5磷酸化增强过氧化物酶体自噬促血管平滑肌细胞增殖”的科学假说。为验证这一假说,本课题通过三个部分对上述假说进行阐述:第一部分apelin-13/APJ诱导过氧化物酶体自噬的发生;第二部分apelin-13/APJ诱导UBL3类泛素化修饰MAPK15诱导PEX5磷酸化增强过氧化物酶体自噬;第三部分UBL3类泛素化修饰MAPK15诱导PEX5磷酸化增强过氧化物酶体自噬介导apelin-13/APJ促血管平滑肌细胞增殖。本研究拓宽了apelin/APJ系统促血管平滑肌细胞增殖的分子机制,为了开发AS相关APJ靶点药物的开发提供了新的理论依据。第一部分Apelin-13/APJ诱导过氧化物酶体自噬的发生目的:探讨apelin对血管平滑肌细胞内过氧化物酶体数量的影响;观察冠状动脉粥样硬化血管以及Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型平滑肌细胞内过氧化物酶体自噬蛋白PEX5、LC3的表达情况;体外实验进一步观察apelin-13是否诱导过氧化物酶体自噬发生。方法:首先使用电镜、免疫电镜以及免疫组化法检测apelin-13对粥样硬化冠状动脉以及Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型血管平滑肌细胞内过氧化物酶体数量的影响以及过氧化物酶体自噬相关蛋白PEX5和LC3的共定位情况,免疫组化观察冠状动脉过氧化物酶体自噬相关蛋白PEX5表达。用apelin-13抑制剂F13A、自噬抑制剂Bafilomycin A1预处理HA-VSMCs,采用免疫荧光、Western blot检测其对apelin-13诱导的PEX5、LC3表达及共定位的影响。PEX5si RNA干预后,使用免疫荧光及Western blot检测观察PEX5 si RNA对HA-VSMCs中PEX5与LC3的表达以及共定位的影响。Western blot检测自噬抑制剂Bafilomycin A对过表达PEX5诱导的血管平滑肌细胞中LC3表达的影响。结果:Apelin-13激活过氧化物酶体自噬,且减少过氧化物酶体的数量;与正常冠状动脉对比,动脉粥样硬化冠状动脉血管平滑肌细胞中PEX5表达增多;而且Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型主动脉平滑肌细胞内PEX5、LC3表达增多,且apelin-13促进过氧化物酶体自噬相关蛋白PEX5与LC3共定位,以上结果表明,apelin-13可促进AS的发展,其原因与激活过氧化物酶体自噬有关。体外细胞实验结果表明,apelin-13浓度依赖性、时间依赖性促进过氧化物酶体自噬相关蛋白PEX5与LC3表达上调,APJ拮抗剂F13A减弱apelin-13诱导的PEX5与LC3表达增多;自噬抑制剂Bafilomycin A1抑制apelin-13诱导血管平滑肌细胞中PEX5与LC3的共定位;PEX5 si RNA减弱apelin-13促血管平滑肌细胞中LC3的表达;PEX5 si RNA减弱apelin-13诱导的LC3与PEX5的共定位;过表达PEX5促进血管平滑肌细胞中LC3和PEX5的表达;Bafilomycin A抑制过表达PEX5诱导的LC3的表达。小结:apelin-13通过促进过氧化物酶体自噬相关蛋白PEX5的表达,从而诱导过氧化物酶体自噬。第二部分Apelin-13诱导UBL3类泛素化修饰MAPK15诱导PEX5磷酸化增强过氧化物酶体自噬目的:探讨apelin-13对UBL3、MAPK15、PEX5与过氧化物酶体自噬的影响,以及之间的相互关系。方法:首先使用生物信息学预测MAPK15、PEX5与apelin-13的关系,以及MAPK15对PEX5的磷酸化修饰位点的预测。使用免疫共沉淀和质谱分析技术确认,apelin-13是否促进MAPK15对PEX5磷酸化修饰。免疫组化观察动脉硬化冠状动脉与Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型血管平滑肌中MAPK15的表达情况。Western blot检测以及免疫荧光,观察apelin-13、F13A、MAPK15-si RNA、PEX5点突变589S质粒、过表达MAPK15质粒、自噬抑制剂Bafilomycin A对MAPK15表达以及过氧化物酶体自噬相关蛋白LC3 PEX5表达和其共定位的影响。后续使用生物信息学预测UBL3、MAPK15、PEX5与apelin-13的关系,以及UBL3对MAPK15类泛素化修饰位点的预测。使用免疫共沉淀技术确认,apelin-13是否促进UBL3对MAPK15类泛素化修饰。免疫组化观察动脉硬化冠状动脉与Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型血管平滑肌中UBL3的表达情况。Western blot检测以及免疫荧光,观察apelin-13、F13A、UBL3-si RNA、MAPK15点突变42K位点质粒对MAPK15表达以及过氧化物酶体自噬相关蛋白LC3、PEX5表达和其共定位的影响。结果:生物信息学预测UBL3对MAPK15存在类泛素化修饰,位点为42K;PEX5第589位丝氨酸存在MAPK15磷酸化修饰作用;质谱以及Co-IP结果显示,UBL3、MAPK15对PEX5存在相互作用,且PEX5 589S位点存在磷酸化修饰,MAPK15 42K位点存在类泛素化修饰。动脉粥样硬化冠状动脉斑块中UBL3和MAPK15的表达较对照组明显增加,apelin-13诱导的Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型主动脉平滑肌细胞中UBL3、MAPK15表达。体外细胞实验结果显示,apelin-13浓度依赖性和时间依赖性促血管平滑肌细胞中UBL3、MAPK15的表达增加,F13A抑制apelin-13诱导的血管平滑肌细胞UBL3、MAPK15的表达。MAPK15-si RNA、PEX5点突变589S质粒、UBL3-si RNA、MAPK15点突变42K质粒抑制apelin-13以及Rapamycin诱导的HA-VSMCs中PEX5、LC3表达。MAPK15-si RNA、PEX5点突变589S质粒、MAPK15点突变42K质粒抑制apelin-13诱导的HA-VSMCs中PEX5、LC3共定位。小结:（1）Apelin-13通过MAPK15磷酸化PEX5促过氧化物酶体自噬,其磷酸化位点为589S;（2）UBL3类泛素化修饰MAPK15介导Apelin-13促过氧化物酶体自噬,其修饰位点为42K。第三部分UBL3类泛素化修饰MAPK15诱导PEX5磷酸化增强过氧化物酶体自噬介导apelin-13/APJ促血管平滑肌细胞增殖目的:探讨UBL3类泛素化修饰MAPK15诱导PEX5磷酸化修饰,进而增强过氧化物酶体自噬介导apelin-13促血管平滑肌细胞增殖。方法:免疫组化观察动脉硬化冠状动脉与Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型血管平滑肌中增殖相关蛋白PCNA的表达情况。CCK8法、Brdu法检测apelin-13诱导血管平滑肌细胞增殖的影响。Western blot进一步检测apelin-13及其APJ抑制剂F13A对血管平滑肌细胞中PCNA量效时效关系。使用CCK8法、Brdu法分别检测PEX5 si RNA、MAPK15 si RNA和UBL3 si RNA对平滑肌细胞增殖的影响,Western blot检测PEX5 si RNA、MAPK15 si RNA和UBL3 si RNA对平滑肌细胞中PCNA的表达的影响,进一步免疫荧光观察PEX5-si RNA和过表达PEX5质粒对apelin-13诱导的血管平滑肌细胞中PCNA表达的影响。分别突变PEX5 589S位点和突变MAPK15 42K位点,CCK8法、Brdu法检测其对平滑肌细胞增殖的影响,Western blot检测其对平滑肌细胞中PCNA的表达的影响。结果:动脉粥样硬化冠状动脉斑块中PCNA的表达较对照组增加,apelin-13诱导的Apo E-/-动脉粥样硬化小鼠模型主动脉平滑肌细胞中PCNA表达。体外细胞实验表明,apelin-13促PCNA的表达增加,且F13A抑制apelin-13诱导的HA-VSMCs中PCNA的表达。PEX5si RNA、MAPK15 si RNA和UBL3 si RNA抑制apelin-13诱导HA-VSMCs的增殖,以及apelin-13诱导的PCNA的表达增加。免疫荧光结果表明PEX5 si RNA抑制apelin-13诱导的血管平滑肌细胞中PCNA表达,Bafilomycin A1抑制过表达PEX5诱导的PCNA表达。突变PEX5 589S位点和突变MAPK15 42K位点抑制HA-VSMCs增殖以及apelin-13和自噬诱导剂Rapamycin诱导的HA-VSMCs中PCNA的表达。小结:Apelin-13通过促进UBL3类泛素化修饰MAPK15,且修饰位点为42K,促PEX5 589位点磷酸化诱导过氧化物酶体自噬促进血管平滑肌细胞增殖。结论:1、Apelin-13可促进过氧化物酶体自噬相关蛋白PEX5的表达,诱导过氧化物酶体自噬;2、Apelin-13诱导MAPK15促PEX5 589S位点磷酸化修饰,进而诱导过氧化物酶体自噬;3、Apelin-13通过UBL3类泛素化修饰MAPK15进而激活过氧化物酶体自噬;4、UBL3-MAPK15-PEX5-过氧化物酶体自噬通路介导Apelin-13/APJ促血管平滑肌细胞增殖。