人肿瘤坏死因子(hTNF)是一个多功能的细胞因子，能够结合hTNF受体(TNF—R1和TNF—R2)发挥其抗肿瘤活性和免役调节活性。系统性给药，hTNF可以诱发荷瘤小鼠肿瘤出血性坏死，期望这一细胞因子可用于抗肿瘤治疗。但是在临床实验中，hTNF的系统性治疗诱发严重的毒性反应，并有剂量依赖性，最大耐受剂量比小鼠的最大耐受剂量低40倍。而局部给药，如隔离性肢体灌注，是提高TNF局部浓度的有效方法，可以使恶性肿瘤消失。目前，通过隔离性肢体灌流hTNF，对肢体软组织肉瘤和转移性黑色素瘤进行治疗，能够替代截肢从而提高病人的生活质量，也可对其它无法进行手术治疗的肿瘤进行隔离治疗，所以增加hTNF在肿瘤局部的浓度是应用hTNF抗肿瘤的关键。 在系统性给药治疗中，选择性的将TNF靶向性地传输到肿瘤部位是改善其治疗效果和减少毒副作用的有效策略。这一策略大多基于能识别肿瘤或肿瘤基质标记物的抗体和一些配体，除了这些标记物，新生血管的标记物配体已经被用于将TNF靶向到肿瘤血管。ACDCRGDCFC(RGD)是一个利用体内噬菌体肽库淘洗技术筛选得到的多肽，它对肿瘤组织的靶向性不依赖于肿瘤来源，而依赖于肿瘤组织新生血管特性。这一基序可以选择性地结合新生血管内皮细胞上高水平地表达αvβ3和αvβ5整合素受体。几项研究表明在隔离性肢体灌注治疗中hTNF的抗肿瘤作用是非直接的，选择性的破坏肿瘤血管是其主要的作用机制，而且hTNF单独治疗效果并不明显，hTNF只有联合化疗才表现很强的抗肿瘤活性，所以将hTNF靶向运输到肿瘤血管是避免其毒副作用、保留其协同抗肿瘤活性的合理策略。为了将hTNF靶向运输到肿瘤新生血管，我们利用基因工程方法设计、构建和表达了RGD肿瘤靶向性肽和hTNF的融合蛋白。 我们的研究结果表明重组融合蛋白保留了RGD肿瘤靶向性肽的整合素受体结合活性和hTNF的生物活性，体内实验表明RGD环肽偶联hTNF可以改善其抗肿瘤活性。为了避免系统治疗的毒副作用，我们研制了三个含RGD基序的人肿瘤坏死因子，分别为RGD—hTNF，、RGD—mhTNF和RGD—L—mhTNF，RGD—hTNF含有野生型的人TNF(hTNF)结构，而RGD—mhTNF和RGD—L—mhTNF均含有突变的人TNF(mhTNF)结构，L代表Gly连接肽。我们试图运用传统的色谱分离技术纯化这三个RGD肽修饰蛋白，但是纯化得率很低，而且很难达到需要的纯度。为此，我们建立了间接ELISA用于分析洗脱组分中的目标蛋白，对柱层析进行过程监测，我们发现目标蛋白不能有效富集，大量目标蛋白和杂蛋白共存，是纯化得率很低的直接原因。所以我们采用基因工程的办法分别在RGD—hTNF、RGD—mhTNF和RGD—L—mhTNF的N端加上组氨酸标签，从而运用金属螯合层析对其进行亲和纯化。在组氨酸标签和RGD—mhTNF之间插入了肠激酶识别位点DDDDK序列，用于亲和标签的去除，对RGD—L—mhTNF也进行了相同构建。先通过第一步镍金属螯合层析来捕获大肠杆菌高效表达的组氨酸标签融合蛋白，再用重组的肠激酶轻链酶切去除组氨酸标签，生成的目标蛋白RGD—mhTNF或RGD—L—mhTNF可以和酶切副产物在第二步镍金属螯合层析纯化中得到分离，最后使用离子交换层析和凝胶过滤层析改善目标蛋白的质量。运用相同的设计对RGD—hTNF进行改造，我们发现组氨酸标签融合蛋白不能被肠激酶特异性酶切，将肠激酶识别位点替换为TEV蛋白酶识别位点后，酶切能够在特异的识别位点进行，所以改用TEV蛋白酶去除组氨酸标签。纯化的策略包括以下几个步骤：1、用镍金属螯合层析进行目标蛋白的捕获；2、融合蛋白的TEV蛋白酶酶切；3、第二次镍金属螯合层析去除酶切反应的副产物；4、凝胶过滤层析进一步提高纯化蛋白RGD—hTNF的质量。通过分离纯化，从1 L的细菌培养产物可以获得高纯度的RGD—hTNF约18 mg。运用SDS—PAGE，Western blot，质谱和凝胶过滤色谱对纯化的RGD—hTNF、RGD—mhTNF和RGD—L—mhTNF进行了定性研究。特别的，利用ESI-MS来检测了目标蛋白RGD—hTNF、RGD—mhTNF和RGD—L—mhTNF的完整性，同时对肠激酶识别的非特异性酶切位点进行了鉴定，发现非特异性酶切位点位于hTNF的2位Arg后。体外实验表明RGD—hTNF等变体蛋自具有和hTNF相类似的细胞毒活性，其RGD结构能够和ECV304细胞表面的整合素分子相结合，所以建立的纯化方法可以为动物实验提供合格的重组蛋白。在B16F1肿瘤动物模型上，RGD—hTNF、RGD—mhTNF和RGD—L—mhTNF均表现出抗肿瘤活性，其中RGD—hTNF和RGD—mhTNF的抗肿瘤活性相当，而RGD—L—mhTNF的抗肿瘤作用要低一点，对照蛋白hTNF和mhTNF均无显著的抗肿瘤作用。在B16F10肿瘤模型和Lewis肺癌模型上，RGD—hTNF却不能显著的抑制实体瘤生长，仅表现边际效应，RGD—mhTNF对Lewis肺癌也没有明显的抗肿瘤效果。临床上，隔离性肢体灌注TNF和化疗药物可以诱导协同的抗肿瘤作用，而单用TNF-α仅能导致弱的中心坏死，并且没有观察到明确的抗肿瘤效果。进一步，在这两种动物模型上，我们均观察到RGD—hTNF联合抗癌中药单体冬凌草甲素(Oridonin)具有协同的抗肿瘤作用，同时验证了RGD—hTNF血管靶向性变体蛋白比野生型hTNF具有更强的联合效果。组织化学分析表明联合RGD—hTNF和Oridonin治疗可诱导B16F10肿瘤更大面积的坏死，TUNEL凋亡分析表明联合RGD—hTNF和Oridonin治疗可促进肿瘤细胞的凋亡，说明在联合治疗组，中药单体Oridonin的抗肿瘤活性得到了增强。为了证明RGD—hTNF也能增强其它化疗药物的抗肿瘤活性，我们在B16F10肿瘤模型上进行了RGD—hTNF联合阿霉素(Doxorubicin)的抗肿瘤实验，同样发现联合RGD—hTNF和Doxorubicin可协同地抑制实体瘤的生长。联合RGD—hTNF和化疗药物进行抗肿瘤治疗对荷瘤小鼠的生存时间有一定的延长。在B16F10肿瘤模型上，RGD—hTNF具有肿瘤新生血管靶向的特性，所以RGD—hTNF可以增强Doxorubicin在肿瘤部位的富集，而hTNF却没有检测到这一活性，这一结果和体内RGD—hTNF联合化疗药物治疗的结果一致，认为RGD—hTNF增强化疗药物的渗透性是其体内联合治疗表现协同效果的重要机制。 抑制NFκB通路的活性，可以增强肿瘤细胞对TNF的敏感性，所以联合RGD—hTNF和NFκB抑制可以诱导直接的抗肿瘤效应，是一种合理的治疗方案。以A549细胞cDNA为模板，我们扩增得到了IκBα的显性负作用蛋白AN—IκBα，由于缺少N端1-36个氨基酸，细胞内过表达可以抑制NFκB的活性。对B16F10细胞，转染ΔN—IκBα表达质粒可以抑制肿瘤细胞的增殖。对于A549细胞，转染ΔN—IrBα表达质粒可诱导细胞凋亡，同时增强hTNF的细胞毒活性。在体内肿瘤生长模型中，ΔN—IκBα可以抑制B16F10实体瘤的生长，但未表现和RGD—hTNF联合治疗的协同效果，分析认为可能由于RGD—hTNF的种属特异性造成，进一步需要在裸鼠动物模型上，验证RGD—hTNF靶向性蛋白联合ΔN—IκBα基因治疗的抗肿瘤作用。总之，本研究在大肠杆菌系统成功表达和纯化了三个RGD肿瘤新生血管靶向性肽修饰蛋白RGD—hTNF、RGD—mhTNF和RGD—L—mhTNF，实验表明RGD—hTNF等变体蛋白具有靶向到肿瘤血管内皮细胞的功能，RGD—hTNF联合化疗具有协同的抗肿瘤效果。