目的:人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）又称艾滋病病毒,可通过破坏机体的免疫系统,引起一系列免疫缺陷相关症状,最终进展为获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）。尽管抗逆转录病毒治疗（Anti-Retroviral Therapy,ART）的应用极大改善了 HIV感染者的疾病进展及死亡情况,但因其巨大的感染基数及日渐复杂的传播情况,以及治疗后免疫重建不良情况的发生,HIV感染仍给全球的卫生医疗带来巨大的负担。探索影响HIV感染疾病进展及预后的相关作用机制,对HIV感染疾病的防控和治疗具有重要意义。在HIV感染的过程中,T细胞作为机体最主要的免疫细胞之一,其数量和功能的变化对HIV感染的疾病进程及治疗效果产生重要的影响。HIV特异性CD8+T细胞应答能够有效杀伤病毒感染细胞,控制HIV病毒血症的发生。与此同时,CD4+T细胞在受到HIV感染后,辅助CD8+T细胞而发挥作用,其维持正常数量和功能对CD8+T细胞的功能发挥具有十分重要的作用。然而,研究已表明,HIV病毒持续感染会导致T细胞的耗竭,损伤T细胞的增殖能力及效应因子的分泌,且由此导致的T细胞的功能失调不能被ART治疗完全逆转。T细胞的功能失调与HIV感染的疾病进展和治疗后的免疫重建密切相关。此外,还有研究指出,HIV感染所致的T细胞功能失调还与免疫重建炎性综合征的发生有关。HIV感染所致的T细胞功能异常被认为与持续抗原刺激、慢性炎症以及细胞的固有缺陷等多种因素有关,但其机制仍未阐明,需进一步探讨。因此,解析HIV感染后T细胞数量和功能变化的影响因素及相关机制,是控制HIV感染,改善预后的重要基础。IL4I1是一种由髓系和B细胞系的抗原提呈细胞,以及辅助性T细胞17（Th17）产生的分泌型L-苯丙氨酸氧化酶,现有研究表明,IL4I1参与了 B细胞和T细胞获得性免疫反应的精细调控,可通过抑制T细胞增殖和细胞因子产生,促进幼稚CD4+T细胞分化为调节性T细胞,在小鼠和人类的获得性免疫反应中发挥了重要作用。但IL4I1是否能够影响HIV感染中T细胞的功能,发挥其免疫调节作用,以及作用的相关机制目前尚未见报道,明确IL4I1与HIV感染之间的关系,以及对HIV感染后T细胞的影响及机制,可为进一步提高HIV感染的疾病控制及预后提供新的思路和靶点。研究方法:1.研究对象本次研究共招募了 32名HIV阴性对照者（HIV negative control,NC）,34名HIV感染未治疗者（HIV）以及42名HIV感染接受ART治疗者（ART）进行PCR及ELISA的检测,用以探索IL4I1与HIV感染之间的关系。随后,我们收集了 50名ART人群的血液样本来分析IL4I1对HIV感染T细胞功能的影响,并招募了 12名ART人群用作转录组数据的样本采集。最后,我们采集了 60名ART人群的样本进行了 IL4I1对HIV感染T细胞功能的影响和机制分析。参与本次研究的受试者均来自中国医科大学附属第一医院,样本采集前,所有受试者均已被告知样本采集的实验用途,并签署知情同意书。本次研究已通过中国医科大学伦理委员会批准。2.外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）分离与 T 细胞分选采用密度梯度离心法对外周血单个核细胞进行分离,离心条件设置为离心力400g,升速5,降速0,30min。T细胞的分选采用STEMCELL公司负选试剂盒应用磁极进行负选获得,分选纯度可达96%以上。3.胞内细胞因子检测分选得到的T细胞,加入CD3/28刺激物后培养24h,第18h加入GolgiStop。培养结束,加入死活染料去除死细胞的影响,随后加入CD4-APC-Cy7、CD8-PerCP-Cy5.5对细胞进行表面标记。应用破膜剂对细胞进行透化后,加入胞内细胞因子相关染料进行染色。数据分析在Flowjo v10.3中进行。4.细胞凋亡分析细胞刺激48h后,首先进行细胞表面maker（CD4,CD8）的标记,之后洗涤细胞,最后在Binding Buffer的环境中加入Annexin V与7AAD染料进行凋亡细胞的标记,染色结束后于1h时内上机检测。5.细胞增殖分析将负选得到的细胞洗涤后重悬于PBS中,加入终浓度为5μM的示踪染料Cell Trace Violet（CTV）标记后,将细胞重悬于R10培养基加入CD3/28 beads进行刺激,置于37℃,5%CO2培养箱中培养120h。培养结束后,将细胞转移至流式管中进行细胞死活以及表面maker的标记,随后上机检测细胞增殖情况。6.细胞RNA的提取及PCR检测采用QIAGEN公司的RNeasy Plus Mini Kit试剂盒对不同人群来源的外周血单个核细胞中的总RNA进行提取,RNA的逆转录及PCR扩增分别根据TaKaRa公司的 PrimeScriptTM RT reagent Kit 及 TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ的试剂说明书进行操作,结果采用2-ΔΔCt进行相对定量计算。7.ELISA检测收集细胞培养上清,根据R＆D公司提供的Human IL-4I1 DuoSet ELISA及其配套的ELISA检测试剂盒的操作说明对细胞培养上清中的IL4I1的含量进行检测,吸光度检测波长范围为450nm,校准波长540nm,IL4I1的浓度采用四参数拟合曲线进行计算。8.线粒体呼吸及糖酵解功能测定根据操作说明,采用Seahorse XF HS Mini分析仪结合XFp Cell Mito Stress Test Kit及XFp Glycoysis Stress Test Kit试剂盒对线粒体呼吸和糖酵解功能进行检测。实验中使用的药物浓度分别为:1.5μM寡霉素（Oligo）,0.5μM线粒体氧化磷酸化解偶联剂（FCCP）,0.5μM鱼藤酮/抗霉素A（R＆aa）,10mM的葡萄糖,50mM的2-脱氧葡萄糖（2-DG）。9.线粒体质量,膜电位及去极化分析应用 50nM 的 MitoTrackerTM Green FM 和 25nM 的 MitoTrackerTMOrange CMTMRos在培养基中分别对细胞的线粒体质量及膜电位进行标记。置于37℃培养箱中孵育30min,孵育结束后,用预冷的PBS洗涤3次,加入死活染料去除死细胞对染色的影响后上机检测。10.活性氧（ROS）检测细胞处理完毕后,根据试剂说明,应用CellROX? Green Reagent试剂对细胞产生的活性氧进行染色,在96孔板的培养基中加入0.4微升的CellROX? Green Reagent后,于37℃培养箱中孵育30min,孵育结束后,用PBS洗涤细胞并进行死活染色,染色结束后重悬细胞,应用流式细胞仪进行检测。11.转录组数据富集分析及绘图根据转录组测序得到的基因表达矩阵中的P值及Fold Change（FC）对基因进行过滤,得到差异表达基因,过滤条件设置为P＜0.05,FC＞1.2。应用图图云平台（https://www.cloudtutu.com/#/index）绘制差异表达基因的火山图。应用仙桃学术网站（https://www.xiantao.love/）的在线生信工具对测序得到的数据进行主成分分析并绘图。应用DAVID网站（https://david.ncifcrf.gov）对得到的差异表达基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路分析。应用 imageGP（http://www.ehbio.com/Im ageGP/index.php/Home/Index/index.html）对得到的 GO 和 KEGG 富集结果进行可视化。12.蛋白质互作网络分析对转录组获得的基因表达矩阵,通过设置P＜0.05,FC＞1.2的过滤条件获取差异表达基因。通过STRING数据平台（https://cn.string-db.org/）进行蛋白质互作网络分析。将得到的数据结果导入Cytoscape进行蛋白互作网络的绘制,并应用Cytoscape中的MCODE及cytoHubba插件对蛋白质互作网络中的核心基因进行筛选。本次分析使用的Cytoscape版本为3.7.1。13.GSEA基因集富集分析根据实验目的,设置对照组及添加IL4I1的实验组,按照GSEA软件的输入要求对表达矩阵及分组情况进行数据格式的整理,整理好后导入GSEA4.1.0软件。根据实验需求设置富集条件,选择富集所用的数据库后运行软件进行富集分析。14.统计学分析采用Mann Whitney test对不同组间IL4I1的表达和分泌差异进行分析。IL4I1与CD4计数及病毒载量之间的相关性采用Spearman相关系数分析。探讨IL4I1对细胞功能的影响及相关机制的分析采用paired t test进行分析。所有统计分析及绘图均在GraphPad Prism v8.0软件上进行。各组数据以Mean±SD进行表示,P＜0.05被认为有统计学意义。*代表P＜0.05,**代表P＜0.01,***代表P＜0.001。结果:1.IL4I1在HIV感染者及免疫不应答者中表达及分泌增加,且与HIV感染的疾病进展相关GEO数据以及PCR的实验结果表明IL4I1在HIV感染后表达上调,ELISA实验数据也表明HIV感染者及免疫不应答者的外周血单个核细胞（PBMC）在接受脂多糖（LPS）刺激后具有更强的分泌IL4I1的能力。将IL4I1的表达和分泌与HIV感染者的CD4+T计数及病毒载量进行相关性分析,发现IL4I1与CD4+T的计数成负相关,与病毒载量正相关。2.IL4I1促进HIV感染T细胞的凋亡及功能失调通过体外的细胞实验证实,IL4I1能够显著促进HIV感染者T细胞的凋亡,并抑制HIV感染CD4+T细胞IL2、IFN-γ等效应因子的分泌,同时通过下调CD8+T细胞颗粒酶B及穿孔素的分泌,影响其细胞毒性功能。3.IL4I1能够显著影响CD8+T细胞基因表达图谱对转录组数据进行分析,通过设定P＜0.05,FC＞1.2的过滤条件来获取差异表达基因。筛选过后,在CD4+T细胞中共得到97个差异表达基因,包括29个上调基因和68个下调基因。在CD8+T细胞中则得到255个下调,420个上调,共675个差异表达基因。对得到的差异基因进行主成分分析及无监督的层次聚类分析,可以发现不同处理的细胞样本优先聚类为一组,显示了 IL4I1处理后样本之间数据的相似性,而这一现象在CD8+T细胞的结果中表现的更为明显,说明IL4I1的处理显著改变了 CD8+T细胞基因表达图谱。4.IL4I1下调HIV感染的CD8+T细胞的氧化磷酸化对在CD8+T细胞中得到的差异基因进行了基因本体论（GO）和KEGG信号通路的分析。结果显示,IL4I1处理CD8+T细胞得到的上调基因主要集中于凋亡和衰老的生物过程,下调基因则富集于电子传递链、氧化磷酸化等信号通路。应用Seahorse细胞能量代谢分析仪结合配套的线粒体压力检测试剂盒Cell Mito Stress Test Kit测定氧气消耗速率（Oxygen Consumption Rate,OCR）来反应细胞的氧化磷酸化水平。结果显示,加入IL4I1后,细胞的氧化磷酸化水平降低。结合GOBP和KEGG的富集分析结果,我们认为IL4I1可能影响了 HIV感染T细胞的氧化磷酸化,进而影响了细胞的功能及凋亡。5.抑制氧化磷酸化可促进HIV感染者CD8+T细胞的凋亡和功能异常通过使用草酸钠（OXA）对丙酮酸激酶（PK）进行抑制来下调氧化磷酸,并由此观察氧化磷酸化下调对细胞功能的影响。结果显示,添加了能够下调氧化磷酸化的草酸钠后,HIV感染的CD8+T细胞的凋亡水平明显增加,同时细胞的穿孔素、颗粒酶B以及IFN-γ的分泌均受到抑制。6.IL4I1下调编码线粒体蛋白的相关基因的表达对通过转录组技术获得的CD8+T细胞的差异基因进行蛋白质互作网络分析,结果显示,线粒体相关蛋白具有更强的相互作用指数。同时,GSEA富集分析结果显示多条线粒体相关信号通路富集于未经过IL4I1处理的细胞分组中。结合蛋白质互作网络分析与GSEA的富集结果,提示IL41下调编码线粒体蛋白的相关基因的表达。7.IL4I1导致线粒体质量增加,活性氧产生增多通过 MitoTrackerTM Green FM 和 MitoTrackerTM Orange 对线粒体的质量量（Mitoc hondrial Mass,MM）和线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）进行检测。结果显示,IL4I1处理后,线粒体的质量（MM）增加。同时使用CellROX?Green试剂对细胞的活性氧（ROS）的生成情况进行了检测。结果显示,IL4I1可以导致ROS的生成增多。8.IL4I1增加HIV感染者CD8+T细胞的线粒体去极化,下调线粒体转录因子A的表达当线粒体受损时,会出现一群高表达线粒体质量（MM）,低表达线粒体膜电位（MMP）的细胞群,称之为去极化线粒体（MMP1ow/MMhigh）,这群线粒体通常意味着线粒体的损伤及单位质量下线粒体活性的降低。我们的研究结果表明,IL4I1会显著增加去极化线粒体的比例。同时,线粒体转录因子A（TFAM）作为一种线粒体DNA转录因子,在IL4I1处理后显著下调。9.抑制线粒体电子传递链能够下调HIV感染者CD8+T细胞的效应功能通过在实验体系中加入线粒体电子传递链复合物的抑制剂,干预线粒体的能量供应,检测其对细胞功能的影响。结果显示,加入线粒体电子传递呼吸复合物V抑制剂寡霉素（Oligo）,以及线粒体电子传递链呼吸复合物Ⅲ和复合物Ⅰ的抑制剂阿霉素（antimycin A）,鱼藤酮（rotenone）以及二甲双胍（metformin）后,HIV感染者CD8+T细胞的效应因子的分泌明显降低,表明线粒体电子传递链活性的降低会损伤HIV感染者CD8+T细胞的效应功能。进一步证实IL4I1通过损伤线粒体下调氧化磷酸化,进而造成HIV感染者CD8+T细胞的功能失调。10.IL41增强HIV感染者CD8+T中p38 MAPK信号通路的磷酸化水平应用流式细胞仪分别对Akt、mTOR及MAPK信号通路的磷酸化情况进行了检测。结果表明,IL4I1可显著上调p38 MAPK信号通路的磷酸化水平,对Akt、mTOR及S6的磷酸化水平未见明显影响。据以上结果,我们认为,IL4I1通过p38 MAPK信号通路造成线粒体的损伤,进而下调氧化磷酸化影响HIV感染者CD8+T细胞的效应功能。结论:1.第一部分研究证实IL4I1在HIV感染者及免疫不应答者中的表达增高,细胞分泌增多。IL4I1与病毒载量成正相关,与CD4+T计数成负相关。证实IL4I1与HIV感染的疾病进展相关。通过将IL4I1与T细胞共培养,我们证实IL4I1可以促进HIV感染的T细胞的功能失调及凋亡,但对T细胞的增殖未见明显作用。2.第二部分的研究表明IL4I1抑制了 HIV感染者CD8+T细胞的氧化磷酸化。下调氧化磷酸化能够促进HIV感染的CD8+T细胞的凋亡,抑制HIV感染的CD8+T细胞的细胞功能。3.第三部分的研究结果表明IL4I1可通过上调p38 MAPK信号通路下调线粒体电子传递链相关基因以及线粒体转录因子A的表达,引起线粒体质量增加,去极化线粒体比例升高及活性氧的生成增多,最终导致HIV感染者CD8+T细胞氧化磷酸化的下调以及细胞的凋亡和功能异常。综上所述,本研究发现IL4I1在HIV感染者中的基因表达升高,外周血单个核细胞分泌增多,且与HIV感染疾病进展的成正相关。并指出IL4I1通过上调p38 MAPK信号通路损伤线粒体,引起氧化磷酸化的下调进而促进HIV感染T细胞的凋亡及功能异常。