目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是仅次于肺癌与胃癌的世界第三大常见恶性肿瘤,也是第二大致死性肿瘤。在过去几十年中,我们对CRC的病因学、分子生物学、流行病学和临床诊治方面的了解有了显著提高。尽管如此,在全世界范围内,每年仍新增至少180万CRC病例。而且,这些病例通常在临床晚期阶段才能做出明确诊断,导致每年约有90万人死于这种恶性肿瘤。此外,虽然人们普遍认为CRC只有在发达国家才具有较高的发病率,但是近年来,在发展中国家中随着饮食和生活方式的改变,CRC的发病率也随之迅速上升。在相对落后国家,现有的筛查方法和可用的医疗手段尚不足以遏制CRC发病率不断上升的趋势。因此,了解CRC的发病因素并且寻找其分子生物学机制,对阻止CRC发生、发展极为重要,且为能够为其得到有效的临床治疗提供策略。凋亡在器官发育、组织稳态及防御机制中起到关键作用,这种防御机制可以清除机体内无用的或具有潜在威胁性的细胞。当细胞的凋亡能力下降时可以导致多种组织病理过程,包括癌症。Caspases的激活是凋亡发生的最终标志,因其激活可导致一系列凋亡相关的严重后果,所以caspases被不同的正向或负向调节因子精确的调控。在活细胞中,凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis proteins,IAP）可直接与caspases结合,抑制caspases活性,对凋亡起负调节作用。因此,必须有IAP拮抗蛋白的存在,通过抑制其活性,促使细胞死亡,维持组织更新。Septin4是最重要的IAP拮抗蛋白,定位于线粒体外膜。在细胞凋亡发生时,Spetin4可从线粒体转运至细胞质并与IAP直接结合,从而激活caspases导致细胞的死亡。并且,Septin4不同于传统的肿瘤抑制因子或致癌基因,是通过丢失或获得某些功能变异导致癌症的发生。Septin4可通过其表达量的改变来影响肿瘤的发生,使其被认为是一种更具普遍性意义的癌症抑制因子。有研究表明,Septin4在急性淋巴细胞白血病患者的骨髓中表达下降,并且,敲除Septin4可通过抵抗凋亡从而增加造血干细胞的比例。在近期研究中也表明,Septin4基因编码的主要蛋白之一:Sept4＿i2/ARTS,在利式肠隐窝微龛中的肠干细胞（Intestinal stem cells,ISCs）中高表达。Sept4＿i2/ARTS可通过促进凋亡调节肠隐窝ISCs数量,维持肠道上皮细胞的稳态与再生。随着Septin4在细胞生物学功能方面研究的深入,充足的证据表明,Septin4参与调控肿瘤细胞的死亡、增殖、血管生成及侵袭,是其标志性分子机制。线粒体凋亡通路受Bcl-2家族成员蛋白调节,能够维持细胞生存与死亡的基本平衡。打破这一平衡可导致细胞病理性增殖,例如癌症、自身免疫性疾病,或细胞病理性死亡,包括神经退行性疾病或骨髓衰竭。线粒体外膜透化（Mitochondrial outer-membrane permeabilization,MOMP）标志着Bcl-2家族调节细胞凋亡结局的发生。BAX属于具有多重BH结构域的促凋亡蛋白成员,定位于线粒体外膜,具有自我组装成同源寡聚体破坏线粒体外膜通透性的能力。BAX几乎存在于所有种类的细胞中,包括肿瘤细胞。促凋亡激活的早期模型认为,BAX的激活受线粒体外膜上抗凋亡成员的抑制性相互作用调节。因此,为了激活细胞凋亡,需要从抗凋亡蛋白复合体中置换出BAX并激活,使其成为同源寡聚体,触发线粒体外膜透化。在这项研究中,我们首先证实Septin4在结肠癌患者癌及癌旁组织中的差异性分布,提示Septin4的低表达可能是结肠癌发生发展的重要因素。然后通过体外实验证实,Septin4参与DOX损伤导致的人结肠癌细胞系（HCT116）的凋亡及活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）释放。过表达Septin4可有效促进DOX诱导的细胞死亡及ROS释放,敲减Septin4可明显抵抗DOX诱导的结肠癌细胞凋亡及ROS产生。在体内实验中,沉默Septin4后可促进裸鼠体内瘤体的生长。通过免疫共沉淀实验,我们首次发现,Septin4可与BAX结合,而这种结合随着凋亡刺激条件的加强而增加,揭示BAX为Septin4的新互作蛋白,并且,Septin4可通过调控BAX的活性行使其促凋亡功能。以上研究揭示,Septin4通过与BAX互作促进细胞凋亡,可能成CRC治疗新的有效靶点。方法:1、结肠癌患者癌及癌旁组织中Septin4蛋白差异性分析;通过对79例人结肠癌及癌旁组织进行免疫组化染色,检测癌及癌旁组织细胞中Septin4蛋白的表达差异,初步探讨Septin4与人结肠癌的发生、发展的关系;应用Kaplan-Meier生存曲线分析患者生存率,对Septin4与结肠癌诊断及预后的关系进行统计学分析。2、体外诱导人结肠癌细胞死亡模型的建立;体外培养人结肠癌细胞系（HCT116）,给与不同浓度梯度DOX刺激,通过CCK8细胞生存试剂盒检测细胞生存率,观察细胞对不同浓度DOX的反应,根据生存率选出半数抑制浓度;通过DHR细胞活性氧染色,检测HCT116细胞在不同浓度DOX刺激条件下,细胞内ROS的生成量,从而检测细胞凋亡;通过Western blot实验检测细胞在DOX刺激条件下,cleaved caspase-3、cleaved PARP1及PCNA蛋白的变化,同时,检测Septin4蛋白的表达变化,初步探讨Septin4与人结肠癌细胞死亡之间的关系。3、检测Septin4在人结肠癌细胞死亡中的作用;3.1构建Flag-Septin4质粒表达载体,给与野生型人结肠癌细胞系HCT116瞬时转染Septin4;细胞过表达Septin4后,给与DOX刺激诱导细胞凋亡,经Western blot检测细胞中cleaved caspase-3、cleaved PARP1及PCNA蛋白的表达变化;通过DHR细胞活性氧染色,检测过表达Septin4的细胞在DOX刺激条件下,细胞内ROS的生成量,从而反应细胞凋亡程度;通过流式细胞凋亡检测仪及TUNEL细胞凋亡染色检测细胞凋亡情况;通过CCK8细胞生存试剂盒检测细胞生存率,观察过表达Septin4的细胞对不同浓度DOX刺激的反应。3.2体外构建Septin4 RNAi及control RNAi干扰载体,纯化并提取质粒,慢病毒载体包装系统共转染病毒包装细胞293T,感染HCT116细胞,构建稳定沉默Septin4基因表达的HCT116细胞系。通过Western blot检测稳定沉默Spetin4的HCT116细胞中,在DOX刺激条件下,cleaved caspase-3及cleaved PARP1蛋白的表达;通过DHR细胞活性氧染色,检测过沉默Septin4的细胞在DOX刺激条件下,细胞内ROS的生成量,从而反应细胞凋亡程度;通过流式细胞凋亡检测仪及TUNEL细胞凋亡染色检测细胞凋亡情况;通过CCK8细胞生存试剂盒检测细胞生存率,观察过沉默Septin4的细胞对DOX刺激的反应。4、体内实验检测Septin4在人结肠癌发生发展中的作用;给与BALB/c裸鼠腋窝分别接种shSeptin4及NC HCT116细胞,观察成瘤情况。对比缺失Septin4基因及野生型移植肿瘤的生长状态,肿瘤体积及重量。5、探索Septin4促进人结肠癌细胞死亡的分子机制;体外培养HCT116细胞,通过免疫共沉淀实验检测Septin4与BAX的相互作用情况;给与细胞DOX刺激,观察Septin4与BAX结合的变化情况。分析Septin4促进人结肠癌细胞死亡的分子机制。结果:1、Septin4蛋白在人结肠癌组织中的表达对比其在癌旁组织中的表达明显降低,差异有统计学意义（P<0.001）;2、Septin4蛋白在人结肠癌组织中的表达与患者性别、年龄及临床TNM分期无关,差异无统计学意义（P>0.05）;3、Septin4蛋白在人结肠癌组织中的表达随着病理学分级的增高而降低,差异有统计学意义（P<0.001）;4、Septin4在人结肠癌组织中的低表达揭示出不良预后及较低的总体生存率;5、Septin4参与DOX诱导的人结肠癌细胞死亡;当细胞死亡增加时,Septin4表达明显升高,并伴随着细胞凋亡蛋白cleaved caspase3及cleaved PARP1的升高,同时,细胞内PCNA蛋白表达降低;6、成功构建Septin4的真核表达载体;构建了稳定敲减Septin4的HCT116细胞系,Septin4的敲减效率在70%以上。7、给与细胞过表达Septin4,在DOX刺激条件下,与对照组相比,细胞死亡增加,细胞内ROS生成增加,细胞凋亡率增加;凋亡相关蛋白cleaved caspase3及cleaved PARP1的表达升高,同时,细胞内PCNA蛋白表达降低。8、当细胞稳定敲减Septin4后,在DOX刺激条件下,与对照组相比,细胞死亡明显减少,细胞内ROS生成减少,细胞抵抗凋亡的能力增加;凋亡相关蛋白cleaved caspase3及cleaved PARP1的表达降低。9、体内裸鼠成瘤实验中,沉默Septin4基因后,与对照组相比,瘤体的体积明显增大,重量明显增加。10、免疫共沉淀结果揭示,Septin4可与促凋亡相关蛋白BAX结合;在DOX刺激条件下,Septin4与BAX结合明显增加。结论:1、Septin4在人结肠癌组织中表达降低,揭示其功能的丢失可能是肿瘤发生发展的关键因素,其低表达与病理学分级的升高相关,并预示不良预后;2、Septin4参与人结肠癌细胞的死亡进程,其高表达可促进人结肠癌细胞死亡,其缺失可加速结肠肿瘤的生长;3、Septin4与促凋亡蛋白BAX的结合增加,是Septin4促进结肠癌细胞死亡的新的关键机制。我们的研究为人结直肠癌的发生发展提供理论依据,且为人结直肠癌的靶向治疗提供新的技术手段。