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目的:本课题利用公共引物介导的多重RT-PCR技术,以常见的白血病融合基因作为检测靶标,目的在于研究建立新型的、系统的、提高PCR检测通量的方法体系,研发适用于临床的常见白血病融合基因检测试剂盒。方法:本课题包括设计公共引物的设计与鉴定、重叠延伸法构建质粒模板、多重检测体系的建立和临床样本检测。(1)用Primer Premier5.0软件以非人基因组为模板进行基础公共引物的设计;采用NCBI网站Primer-blast功能进行公共引物与人基因组、人c DNA的特异性的理论比对;理论设计和筛选的公共引物分别与人基因组和人c DNA进行特异性温度梯度PCR实验验证;将实验验证后的公共引物序列连接到人类一段GAPDH基因的两端,插入到载体中构建质粒,利用含公共引物的质粒模板检测公共引物扩增的敏感性;(2)文献检索和数据库筛选本课题多重体系的白血病融合基因检测靶标;通过重叠延伸法将位于人c DNA上不同位置的两个基因片段通过PCR技术扩增获得后连接在一起,插入载体构建包含检测靶标融合基因的突变型质粒模板:BCR/ABL e1a2型和e13a2型、PML/RARαL型和S型、E2A/PBX1 I型、AML1/ETO、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL和CBFβ/MYH11 A型,另有一包含SIL/TAL1型融合基因的质粒模板通过直接合成法获得;(3)利用Primer Premier5.0设计检测靶标基因特异性引物,将公共引物连接在靶标特异引物的5’末端构成嵌合引物,利用NCBI网站Primer-blast功能进行嵌合引物的比对、修改和筛选,同时利用MFE2.0软件进行体系多重引物的比对和修改;本课题针对常见的白血病融合基因设计了2个多重检测体系,体系1针对BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1融合基因型;体系2在体系1基础上添加检测靶标E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1;通过构建的包含白血病融合基因的突变型质粒模板进行体系特异性和敏感性检测。将PCR扩增得到的产物用琼脂糖凝胶电泳检测后通过紫外凝胶成像系统分析结果,进行多重体系的构建和优化;(4)收集正常人及白血病患者的外周血,根据TRIzol一步抽提法获得人total RNA,6随机引物和MMLV逆转录酶进行逆转录反应获得c DNA;采用本课题构建的多重体系进行临床标本的检测,同时对比临床检测结果分析和评价公共引物介导的多重RT-PCR体系。结果:本课题成功建立了筛选公共引物的方法体系;设计了三对公共引物,通过与人基因组、人c DNA的理论和PCR实验比对,结果均无产物;其中一对公共引物与包含公共引物序列的质粒载体进行敏感性PCR检测时,检测结果可达100个拷贝,选取该公共引物用于课题后期构建多重检测体系。采用重叠延伸技术成功构建了十个包含白血病融合基因的突变型质粒模板;本课题设计的两个针对常见白血病融合基因的多重检测体系均可特异、敏感地检测白血病融合基因。体系1可有效检测针对BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1这4种融合基因的6个突变型质粒模板,即BCR/ABL e1a2型、PML/RARαS型、E2A/PBX1 I型、BCR/ABL e13a2型、PML/RARαL型和AML1/ETO型,其敏感性检测结果依次为103,102,102,10,103和102拷贝。体系2针对BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα、E2A/PBX1、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1这9种融合基因的11个突变型检测模板,即BCR/ABL e13a2型、TEL/AML1型、BCR/ABLe1a2型、PML/RARα的L型、PML/RARαS型、AML1/ETO、E2A/PBX1 I型、E2A/HLF型、TEL/ABL型、CBFβ/MYH11A型和SIL/TAL1型,其敏感性检测结果依次为:102,102,103,103,103,103,103,103,103,104,104拷贝。运用这两个多重体系对55例临床标本进行检测时,检测结果均与医院临床诊断结果一致。结论:本课题构建的基于公共引物介导的多重RT-PCR检测体系可有效提高多重PCR检测通量,对常见白血病融合基因的临床诊断具有较高的敏感性和特异性。