背景与目的多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma Mutiform,GBM）是目前临床上最常见的颅内原发性中枢神经系统肿瘤,临床患者的一般预后极差,且大部分患者常表现出对化疗药的原发性与继发性耐药。替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）,一种咪唑类衍生物,是较为广泛使用的抗胶质瘤化疗药。手术仍为临床第一选择,对胶质瘤患者进行基于神经外科手术后的替莫唑胺辅助化疗已被广泛应用,但由于很多患者对TMZ的耐药性导致不是所有患者在临床上都会受益。耐药患者体内经TMZ给药后诱导产生的O（6）-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O（6）-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT）的表达是最重要的抗TMZ决定因素,其表达可导致GBM细胞出现原发和继发耐药性,目前迫切需要能解决或逆转这种耐药的新型治疗方案。结合既往研究及本课题组前期结果发现,来自天然植物诸如葡萄和花生中的白藜芦醇（Resverotral,Res）对某些肿瘤细胞呈现较为明显的抑制作用及治疗剂量下的良好安全性,比如其对甲状腺癌、膀胱癌、卵巢癌等多种肿瘤细胞的生长均有显著抑制。已有较多文献报道将白藜芦醇与化疗药进行配伍给药后治疗肿瘤的体内外实验,研究表明白藜芦醇可以通过协同给药方式提高肿瘤对许多化疗药如吉西他滨、长春新碱、紫杉醇的敏感性。同时,由于白藜芦醇较低的水溶性、代谢迅速、生物利用度低而影响其发挥多种有益的药理活性,故一定程度限制了其发展应用。通过协同给药,也可提高白藜芦醇的生物利用度,促其从基础研究早日向临床转化。前期已有文献报道利用白藜芦醇与TMZ化疗药进行联合给药治疗胶质瘤,但采用该联合给药法是否对胶质瘤细胞具有广谱性,以及针对白藜芦醇及TMZ具有双重欠敏感性的胶质瘤细胞系,联合给药后是否具有逆转细胞对这两种药物的双重欠敏感性的可能有待进一步细致的探讨。且白藜芦醇虽有抗肿瘤活性但也面临与TMZ类似的耐药问题。由于抗癌药物配伍是克服肿瘤细胞耐药性的有效途径,我们进一步探讨通过白藜芦醇与替莫唑胺联用给药提高GBM治疗敏感性的可能。此外白藜芦醇的体内生物利用度限制使得常规体内给药如口服给药、腹腔注射等给药方式难以到达颅内胶质瘤病灶,本课题组前期建立的鞘内给药模型已在原位移植胶质瘤SD大鼠体内取得一定疗效,但腰穿给药的有创给药方式极易使临床患者产生不适以及具有一定的副作用如反复给药易增加感染风险,我们继续探索了新型的白藜芦醇经鼻给药治疗方式以期在达到疗效的同时将损伤和副作用降到最低。本研究选用对白藜芦醇和替莫唑胺较敏感的RG-2细胞系和对两者均欠敏感的LN-18和LN-428 GBM细胞系,通过分析细胞存活率、细胞凋亡、周期变化等药效分析及分子机制研究,探讨STAT3信号通路、肿瘤相关蛋白Galectin-1表达变化以及耐药蛋白MGMT表达变化等,系统观察了白藜芦醇和替莫唑胺及其不同剂量配伍对这些细胞系生长和死亡的影响。同时构建SD大鼠RG-2细胞原位胶质瘤移植模型,在荷瘤大鼠体内通过白藜芦醇经鼻给药治疗后检测大鼠相关存活指标以及对标本进行凋亡学及其分子机制分析,验证经鼻给药的可行性,为进一步提高白藜芦醇的临床广泛应用度提供基础实验依据。材料与方法大鼠胶质瘤母细胞瘤RG-2细胞系、人源胶质母细胞瘤LN-18和LN-428细胞系均由瑞士洛桑大学医学院神经外科实验室提供。SD大鼠由大连医科大学实验动物中心提供。本研究借助实验室前期研制的高通量细胞爬片皿（中国发明专利号:ZL201520113833.9）建立白藜芦醇与替莫唑胺体外联合给药模型,在不同检测时间点收集不同剂量药物作用后的细胞爬片,通过MTT细胞存活实验以及形态学染色分析胶质母细胞瘤对白藜芦醇及替莫唑胺的敏感性差异以及不同浓度配伍给药的抑制效果,确定针对不同敏感性细胞系的有效浓度配伍剂量。进一步利用MTT（Methyl thiazolyl-tetrazolium,MTT）实验、HE（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色、流式细胞仪结合Annexin V-PI（Propidium iodide,PI）染色、TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling assay,TUNEL）等方法验证通过有效浓度配伍给药协同增敏的可行性。通过免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）、免疫蛋白印记分析（Western-blotting）从分子水平观察TMZ耐药蛋白MGMT,肿瘤相关蛋白Galectin-1以及与替莫唑胺和白藜芦醇耐药均相关的凋亡信号通路STAT3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）及其磷酸化蛋白p-STAT3以及STAT3下游抗凋亡蛋白Bcl-2、细胞存活蛋白survivin蛋白表达变化,探讨白藜芦醇与替莫唑胺体外联合给药协同增敏的可能作用机制。体内实验中,我们在构建大鼠恶性胶质瘤原位移植模型的基础上,随机将大鼠分成经鼻溶剂对照组与白藜芦醇经鼻给药组进行每日两次滴鼻治疗。通过记录生存时间进行对比,利用免疫组织化学（IHC）分析给药后肿瘤增殖活性抗原（Ki-67）的变化,TUNEL染色分析给药后肿瘤细胞的凋亡情况,验证大鼠术后模型经过经鼻白藜芦醇治疗后治疗效果的真实性和可靠性。通过Western-blotting、免疫组织化学（IHC）等方法从分子水平对白藜芦醇抗胶质瘤作用的内在分子机制进行进一步探讨。结果一、大鼠胶质母细胞瘤RG-2细胞及人胶质母细胞瘤LN-18、LN-428细胞对白藜芦醇与替莫唑胺的敏感性差异及有效浓度配伍给药增敏的可行性分析1.MTT细胞存活实验与HE染色结果显示,RG-2细胞经常规剂量白藜芦醇与替莫唑胺处理后细胞生长明显受抑,出现凋亡征象;而同浓度白藜芦醇与替莫唑胺对LN-18与LN-428细胞无较明显生长抑制作用。2.常规剂量白藜芦醇可显著逆转RG-2细胞系对替莫唑胺的耐药性作用。RG-2细胞对白藜芦醇的敏感性明显高于替莫唑胺作用组,替莫唑胺在高浓度（T750,T1000,T1250,T1500）作用下能较充分发挥肿瘤杀伤效应;单独低浓度（T250,T500）作用于RG-2细胞未出现以上变化。当以常规浓度白藜芦醇（R100）联合低浓度替莫唑胺（T250,T500）给药作用于RG-2细胞48h后细胞生长受抑程度均比单独高浓度替莫唑胺（T750,T1000,T1250,T1500）作用组明显。3.低浓度白藜芦醇与替莫唑胺配伍给药可有效抑制RG-2细胞生长,高浓度白藜芦醇与替莫唑胺配伍给药可抑制LN-18和LN-428细胞生长。MTT细胞存活实验与HE染色结果显示,当以R25、R50、R75分别与T250、T500配伍给药作用于RG-2细胞后细胞生长抑制作用比单独给药组增强,且与配伍浓度剂量的增加和时间推移呈正相关。以R50、R75、R100分别与T500、T75配伍给药作用于LN-18、LN-428细胞48小时后细胞生长抑制作用比单纯给药组增强,且与配伍浓度剂量的增加呈正相关;提示药物之间存在互相增敏作用,且在不同细胞系中的增敏效果与药物敏感性密切相关。4.有效剂量白藜芦醇与替莫唑胺配伍给药可同时逆转LN-18和LN-428细胞以及RG-2细胞耐药性。经R25/T250给药作用于RG-2细胞48小时后,MTT细胞存活实验显示细胞存活率下降,HE染色与TUNEL检测结果显示细胞形态变化明显,出现显著凋亡形态学变化。流式细胞仪检测结果表明,R25/T250给药可显著诱导RG-2细胞发生凋亡,细胞周期阻滞于S期。经R75/T750作用于LN-18、LN-428细胞48小时后,MTT细胞存活实验显示两种细胞细胞存活率较单纯给药组相比明显下降,HE染色与TUNEL检测结果一致,细胞形态变化呈现凋亡形态学变化,流式细胞仪检测结果表明,T75/T750给药后可显著诱导LN-18、LN-428细胞发生凋亡,细胞周期阻滞于G₀/G₁期。二、有效浓度配伍给药逆转LN-18和LN-428细胞以及RG-2细胞对白藜芦醇与替莫唑胺的耐药性分子机制研究1.Western-blotting和ICC染色结果显示MGMT蛋白表达于正常培养的RG-2细胞胞内,与替莫唑胺单独用药相比,R25/T250配伍给药后胞内MGMT表达水平下调44.9%,具有统计学意义（P<0.01）;正常培养的LN-18与LN-428细胞中MGMT蛋白均有表达,与替莫唑胺单独用药相比,R75/T750配伍给药作用于LN-18与LN-428细胞后细胞胞内MGMT蛋白同样发生下调（LN18:38.7%,P<0.05;LN428:33.5%,P<0.01）。2.Western blotting和ICC结果显示正常培养RG-2细胞表达Galectin-1蛋白,R25/T250给药后胞内Galectin-1表达水平上调72.6%（P<0.05）。正常培养的LN-18和LN-428中均有Galectin-1蛋白的表达,经R75/T750给药48小时后细胞内Galectin-1蛋白表达水平发生上调（LN18:79.3%,P<0.05;LN428:41.5%,P<0.05）。3.Western blotting和ICC结果显示RG-2细胞胞内表达STAT3蛋白,R25/T250配伍给药后胞内STAT3表达水平下调25.4%（P<0.01）;LN-18和LN-428中STAT3蛋白有表达,R75/T750给药48小时后胞内STAT3蛋白表达水平均下调（LN18:47.2%,P<0.05;LN428:47.4%,P<0.05）。Western blotting与ICC结果显示RG-2细胞胞内表达p-STAT3（Y705）蛋白,R25/T250给药后胞内p-STAT3（Y705）表达水平明显下调71.2%（P<0.01）;LN-18、LN-428中p-STAT3（Y705）蛋白有表达,R75/T750给药48小时后胞内p-STAT3（Y705）蛋白表达水平均下调（LN18:45.7%,P<0.05;LN428:32.6%,P<0.05）。4.Western blotting及ICC结果显示正常培养的RG-2细胞胞内表达survivin蛋白,R25/T250给药后胞内survivin表达水平下调56.9%（P<0.05）;LN-18、LN-428中survivin蛋白有表达,R75/T750给药48小时后胞内survivin蛋白表达水平均下调（LN18:43.5%,P<0.05;LN428:24.7%,P<0.05）。正常培养的RG-2细胞表达Bcl-2蛋白,R25/T250给药后胞内Bcl-2表达水平下调45.9%（P<0.05）;LN-18和LN-428中Bcl-2蛋白有表达,R75/T750给药48小时后胞内Bcl-2蛋白表达水平均下调（LN18:36.4%,P<0.05;LN428:34.2%,P<0.05）。三、白藜芦醇经鼻靶向治疗SD大鼠原位移植RG-2细胞胶质瘤的结果分析1.白藜芦醇经鼻给药治疗可抑制肿瘤生长并延长模型大鼠的生存时间。经鼻溶剂对照组平均生存时间为16.2±1.5天,经鼻给药治疗组中大鼠的平均生存时间为20.4±2.8天。统计学分析结果为治疗组大鼠生存时间得到延长;t检验分析结果为治疗组与对照组的P值小于0.05,存在统计学差异。生存寿命图也证明,治疗组大鼠的生存率和生存时间明显优于对照组。2.白藜芦醇经鼻给药可抑制胶质瘤细胞的增殖活性并诱导其发生凋亡。肿瘤组织石蜡脱水包埋后组织切片,HE染色和病理学观察分析结果证明,经鼻溶剂对照组的肿瘤组织结构完整,肿瘤细胞生长旺盛,密集成簇,肿瘤组织周边呈侵袭性生长;经鼻给药治疗组的移植瘤内可见大量肿瘤细胞死亡并形成液化坏死灶,且以血管周边为甚,肿瘤组织周边比较规整,未见明显的侵袭性生长。免疫组织化学（IHC）分析表明溶剂对照组的肿瘤细胞增殖活性较强（Ki-67表达呈阳性）,给药治疗组的肿瘤细胞的Ki-67阳性表达明显减弱。TUNEL结果显示:对照组肿瘤组织区域,仅可见少量单个细胞呈阳性反应,治疗组的肿瘤组织区域中发现大量密集阳性反应细胞。3.白藜芦醇体内经鼻治疗有效抑制胶质瘤细胞中STAT3信号转导通路的活化并下调其下游分子表达。IHC分析表明,未经过白藜芦醇经鼻给药的对照组的肿瘤细胞存在STAT3的表达,而治疗组的肿瘤细胞STAT3的表达水平明显下降。而STAT3的磷酸化（p-STAT3）情况为,对照组中p-STAT3的阳性染色主要位于胶质瘤细胞的细胞核中,经治疗后胶质瘤细胞核中的阳性染色明显减弱。与之对应,STAT3的下游效应因子Bcl-2在治疗组肿瘤细胞中的表达水平明显下调,而在对照组肿瘤细胞中的表达一直维持在较高水平。Western blotting灰度分析的结果表明,白藜芦醇经鼻治疗模型大鼠可引起脑中肿瘤组织中STAT3（28%）,p-STAT3（37%）及其下游Bcl-2（32%）的表达水平明显下降。4.白藜芦醇体内经鼻给药可显著上调胶质瘤细胞中GFAP蛋白表达。IHC结果提示正常鼠脑对照组标本中GFAP蛋白呈现强阳性表达,经鼻溶剂对照组呈弱阳性表达,白藜芦醇鼻腔给药组GFAP表达明显增强,呈阳性表达。Western blotting结果显示,经鼻溶剂对照组标本中可检测出GFAP蛋白表达,但当以白藜芦醇经鼻给药进行药物治疗后RG-2细胞胞内GFAP蛋白表达水平发生上调（P<0.05）,结果提示星形细胞标志物表达在经鼻腔给药治疗后表达有逆转趋势。结论1.常规剂量100μM白藜芦醇与常规剂量500μM替莫唑胺可有效抑制RG-2细胞生长,而LN-18和LN-428细胞对二者敏感性较低,药物敏感程度为RG-2>LN-18>LN-428。2.替莫唑胺以剂量相关方式诱导RG-2细胞分化和凋亡,低剂量替莫唑胺联合R100可显著抑制细胞增殖。3.低剂量替莫唑胺（T250,T500）联合低剂量白藜芦醇（R25,R50,R75）对RG-2细胞具有比单药更明显的杀伤作用,且随时间推移增强,提示两种药物之间存在相互增敏作用。4.LN-18和LN-428细胞经高浓度白藜芦醇与替莫唑胺配伍给药后可诱导细胞发生凋亡并引起细胞发生周期阻滞,以上结果提示针对不同敏感性的胶质瘤细胞系需提供不同有效浓度剂量配伍给药以提高个体化治疗效果以及减少药物副作用。5.TMZ给药后胞内MGMT蛋白的高表达状态与胶质瘤患者对替莫唑胺的耐药性发生呈现直接正相关,可能是逆转胶质瘤患者耐药性的靶点之一。有效低浓度白藜芦醇与替莫唑胺配伍给药作用于RG-2细胞、高浓度白藜芦醇与替莫唑胺配伍给药作用于LN-18、LN-428细胞后均可下调胞内MGMT蛋白表达水平。6.有效浓度白藜芦醇与替莫唑胺配伍给药作用于RG-2,LN-18,LN-428细胞后胞内Galectin-1蛋白表达水平均发生不同程度上调。7.STAT3信号通路的活化与胶质母细胞瘤的发生发展呈现正相关,有效浓度白藜芦醇与替莫唑胺联合给药处理胶质母细胞瘤细胞后可显著抑制STAT3信号通路,相应的p-STAT3（Y705）及其下游基因Bcl-2、survivin的表达均呈下调趋势。8.白藜芦醇经鼻给药靶向治疗SD大鼠颅内RG-2胶质母细胞瘤可以延长胶质瘤原位移植瘤大鼠的生存周期,抑制胶质瘤生长。9.白藜芦醇经鼻靶向脑胶质瘤是通过增强颅内原位胶质瘤细胞移植瘤的凋亡,下调胶质瘤组织内Ki67表达等途径达到对胶质瘤的治疗目的。10.胶质瘤组织经白藜芦醇经鼻给药治疗后STAT3信号通路及下游Bcl-2蛋白受到抑制,从而发挥出抗肿瘤活性。11.白藜芦醇经鼻治疗大鼠颅内原位胶质母细胞瘤后胶质瘤组织星形细胞标志物GFAP表达升高。