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草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)的多年生草本植物。草莓作为全球重要的经济水果作物,具有丰富而良好的营养和保健功能,同时又具备生产周期短和经济效益好的优点而受到广大消费者和种植者的欢迎。提升果实的产量和品质一直是草莓育种者和栽培者们关注的重点,但由于草莓果实的产量和品质受营养生长、开花时间和环境适应性等多方面因素的影响和制约,因此,对草莓生长发育调控的研究也一直是草莓育种者和栽培者关注的热点和焦点。光作为植物能量的来源,是影响植物生长发育的关键环境因素。但同属于光信号的光周期、光强和光质对植物生长发育的影响存在差异,其中光质起着更为重要的作用。此外,不同光质对植物生长的影响也存在差异,生产上常用补充红蓝光的形式来调节植物生长和提高园艺产品的品质。蓝光受体主要由隐花色素(Cryptochrome,CRY)和向光素(Photoropin)组成,其中CRY蛋白在吸收和传导蓝光信号方面起主导作用,是植物多种生物学过程中的关键因子。虽然CRY基因调节模式植物拟南芥去黄化、开花和响应逆境胁迫的调控模型已有报道,但其在包含草莓在内的园艺作物中的研究鲜见报道。本研究以八倍体栽培草莓‘红颜’(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’),二倍体森林草莓‘Ruegen’(Fragaria vesca‘Ruegen’)和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)为研究材料,利用生物信息学分析、胁迫处理、酵母双杂交文库筛选、过表达和ami RNAi(artificial micro-interfering RNA interference)沉默CRY2草莓株系、过表达CRY1烟草株系、转录组测序等手段,探讨了CRYs基因在草莓中的功能,以及cry2突变造成的性状影响和相关的关键基因变化。形成了以下的研究结果:(1)通过同源克隆法获得‘红颜’草莓CRY1和CRY2的基因全长以及启动子序列,分别为2022 bp和1941 bp,以及1981 bp和2000 bp。生物信息学分析表明,Fa CRY1和Fa CRY2基因的碱基序列和氨基酸序列的相似度分别为56.28%和50.74%;Fa CRY1蛋白具有DNA光解酶、DNA光解酶的FAD结合域和C端结构域(蓝色/紫外线传感蛋白C端)三个保守结构域,而Fa CRY2只有前两个保守结构域。系统发育树分析结果表明,Fa CRY与Fv CRY和其他蔷薇科物种的CRY有共同的古代起源,而与拟南芥和番茄的CRY的关系较远。利用Plant-CARE在线工具分析Fa CRY1和Fa CRY2基因启动子的顺式作用元件表明,在Fa CRY1和Fa CRY2启动子中分别有32和35种顺式调控元件。除了具有高等植物基本转录调控的核心元件如CAAT-box、TATA-box和A-box等外,Fa CRYs具有参与光、激素以及各种非生物胁迫等信号的转导元件。(2)利用q RT-PCR对Fa CRY1和Fa CRY2基因在‘红颜’草莓不同组织和果实不同发育时期中的相对表达量进行分析表明,CRY1主要在功能叶和果实中表达,且在草莓果实色素开始积累的始红期大量表达;CRY2主要在功能叶和花中表达,在果实中相对表达量最低且在不同发育阶段无显著变化。(3)通过4℃低温、10%PEG-6000干旱和200 mm Na Cl胁迫分别处理二倍体草莓‘Ruegen’组培苗表明,除了低温下CRYs的差异表达以及干旱胁迫下草莓叶中CRY2表达无显著变化外,干旱和盐胁迫能均显著诱导CRY1和CRY2在草莓根和叶中的表达,其中的盐胁迫对CRYs表达的影响最大。(4)构建由35S启动子驱动的含有Fa CRY蛋白和绿色荧光蛋白(Fa CRY::GFP)的融合蛋白以及带有红色荧光蛋白的HY5-m Cherry进行CRYs蛋白的亚细胞定位表明,CRY1定位于细胞质和细胞核,CRY2定位于细胞核。(5)利用酵母双杂文库筛选,并结合回转试验获得了5个可能与CRY1蛋白相互作用的涉及生长发育、成花转变和胁迫响应的蛋白。(6)对‘红颜’草莓cry2沉默突变体进行观测和分析表明,突变体草莓生长延缓,其内源IAA积累显著降低,叶柄组织细胞木质化程度和细胞密集程度增高。RNA-seq分析表明,cry2突变体草莓生长延缓可能是IAA和细胞发育相关基因的下调所致。CRY2基因的沉默对下游重要转录因子HY5和成花基因CO的表达无显著影响,但会显著降低成花基因FT1的表达。(7)以八倍体栽培草莓‘红颜’为背景,构建了2个独立的Fa CRY2过表达株系;以本氏烟草为背景,构建了3个独立的Fa CRY1过表达株系。通过q RT-PCR分析发现CRY1基因能显著促进下游重要转录因子HY5的表达,并促进重要的成花相关基因CO和FT1的表达。类似沉默突变体,过表达CRY2基因对草莓叶中HY5的表达也无显著影响,但能促进CO和FT1基因的表达,这与草莓CRY1和拟南芥CRY2存在差异,但具体机制有待挖掘和进一步研究。