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慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)是全球范围内的公共健康问题之一。肾间质纤维化是各种肾慢性疾病发展到终末期的共同生理过程，因此防治肾间质纤维化是治疗慢性肾病的重要治疗策略。目前，临床上针对肾间质纤维化尚无特效药物，对其病程的评估主要采取创伤的肾活检，可导致严重的并发症。迄今为止，临床上CKD的分期诊断主要基于估计的肾小球滤过率(eGFR)和蛋白尿，然而这两项指标易受性别、年龄、肌肉质量等多种因素的干扰导致病程的错误估计，延误疾病的及时诊断。因而寻找新的生物标志物来区分CKD进展，以便于在早期阶段区分CKD患者，对于慢性肾病的治疗具有重要意义。本文基于代谢组学寻找早期CKD的诊断标志物，同时通过代谢网络和分子通路网络研究大黄酸和姜黄素联用延缓肾间质纤维化的协同作用机制。
论文的第一、二部分基于细胞和大鼠尿液代谢组学，发现了肾间质纤维化的潜在生物标志物，从代谢通路角度分析阐明了大黄酸、姜黄素及其联用延缓肾间质纤维化可能的作用机制。第一部分，首先使用ELISA实验检测肾成纤维细胞(NRK-49F)细胞外纤连蛋白(FN)的含量，确定了体外大黄酸和姜黄素以及联用时的给药浓度。然后基于UPLC-QTOF-MS代谢组学对细胞样品进行分析，通过Progenesis QI软件进行峰对齐、解卷积和归一化等处理得到934个离子。随后采用SIMCA软件对代谢组学数据进行多元统计分析，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。通过变量权重重要性排序(variable importance in the projection,VIP)、样本之间代谢物浓度的差异倍数(Fold Change,FC)、t检验分析和ROC曲线分析等，筛选出134个差异代谢物并鉴定出3个体外肾间质纤维化标志物，分别为MG(0∶0/20∶3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0∶0/18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z))和PC(18∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z))。最后运用Metabo Analyst4.0平台对134个差异代谢物进行代谢通路富集分析，结果表明大黄酸和姜黄素联用后通过参与甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢通路产生延缓肾间质纤维化的协同保护作用。
论文的第二部分构建了肾间质纤维化大鼠模型(UUO)，首先通过测量大鼠血清肌酐、尿素氮的含量变化以及观察肾组织HE和Masson染色切片，验证了大黄酸和姜黄素联用对体内肾间质纤维化的协同保护作用。另外基于UPLC-QTOF-MS代谢组学对大鼠尿液样本进行分析，通过Progenesis QI软件进行峰对齐、解卷积和归一化等处理得到2585个离子。然后采用SIMCA软件对代谢组学数据进行PCA和OPLS-DA多元统计分析。通过VIP值、FC值、P值和曲线下面积(AUC)值等筛选出172个差异代谢物并鉴定出5个体内肾间质纤维化标志物，分别为L-谷氨酸5-磷酸、α-亚麻酸、二十二碳六烯酸、美立比醇和脱氧肌苷。本部分实验结果表明大黄酸和姜黄素联用后可以通过参与精氨酸和脯氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢、半乳糖代谢以及嘌呤代谢通路产生延缓肾间质纤维化的协同保护作用。综上所述，大黄酸和姜黄素联用后可以在体内及体外共同通过调节脂质标志物水平(MG(0∶0/20∶3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0∶0/18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z))、PC(18∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z))、α-亚麻酸和二十二碳六烯酸)，参与脂质代谢途径(甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成途径)对肾间质纤维化产生协同保护作用。
论文的第三部分，利用实验构建肾间质纤维化分子网络模型，模拟大黄酸和姜黄素联用的协同延缓肾间质纤维化作用机制。首先，在分子水平上，构建了大黄酸和姜黄素干预的肾成纤维细胞的分子网络常微分方程(Ordinary differential equation,ODE)模型，模拟两者联用对肾间质纤维化进程的延缓作用。结果显示，10ng/mL转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor，TGF-β1)刺激下较1ng/mL TGF-β1明显出现纤维化症状。在5ng/mL大黄酸干预下，TGF-β1、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、细胞周期蛋白(Cyclin)、ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)和白介素-6(IL-6)浓度明显降低，同时出现滞后现象；5μM姜黄素干预时TGF-β1、ECM、MCP-1、Cyclin、ɑ-SMA和IL-6浓度较10ng/mLTGF-β1刺激时有所下降，纤维化程度降低但效果较大黄酸干预时不明显；当5ng/mL大黄酸和5μM姜黄素联合刺激时，各物质浓度较大黄酸或姜黄素单用时更为减少，与第一部分中的实验结果一致，佐证了大黄酸和姜黄素联用对体外肾间质纤维化的协同保护作用。大黄酸和姜黄素联用时可能通过直接作用于MAPK、NF-κB和JAK/STAT3信号通路从而间接刺激TGF-β/Smad信号通路对肾间质纤维化产生协同保护作用。
论文的第一、二部分基于细胞和大鼠尿液代谢组学，发现了肾间质纤维化的潜在生物标志物，从代谢通路角度分析阐明了大黄酸、姜黄素及其联用延缓肾间质纤维化可能的作用机制。第一部分，首先使用ELISA实验检测肾成纤维细胞(NRK-49F)细胞外纤连蛋白(FN)的含量，确定了体外大黄酸和姜黄素以及联用时的给药浓度。然后基于UPLC-QTOF-MS代谢组学对细胞样品进行分析，通过Progenesis QI软件进行峰对齐、解卷积和归一化等处理得到934个离子。随后采用SIMCA软件对代谢组学数据进行多元统计分析，包括主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。通过变量权重重要性排序(variable importance in the projection,VIP)、样本之间代谢物浓度的差异倍数(Fold Change,FC)、t检验分析和ROC曲线分析等，筛选出134个差异代谢物并鉴定出3个体外肾间质纤维化标志物，分别为MG(0∶0/20∶3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0∶0/18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z))和PC(18∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z))。最后运用Metabo Analyst4.0平台对134个差异代谢物进行代谢通路富集分析，结果表明大黄酸和姜黄素联用后通过参与甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢通路产生延缓肾间质纤维化的协同保护作用。
论文的第二部分构建了肾间质纤维化大鼠模型(UUO)，首先通过测量大鼠血清肌酐、尿素氮的含量变化以及观察肾组织HE和Masson染色切片，验证了大黄酸和姜黄素联用对体内肾间质纤维化的协同保护作用。另外基于UPLC-QTOF-MS代谢组学对大鼠尿液样本进行分析，通过Progenesis QI软件进行峰对齐、解卷积和归一化等处理得到2585个离子。然后采用SIMCA软件对代谢组学数据进行PCA和OPLS-DA多元统计分析。通过VIP值、FC值、P值和曲线下面积(AUC)值等筛选出172个差异代谢物并鉴定出5个体内肾间质纤维化标志物，分别为L-谷氨酸5-磷酸、α-亚麻酸、二十二碳六烯酸、美立比醇和脱氧肌苷。本部分实验结果表明大黄酸和姜黄素联用后可以通过参与精氨酸和脯氨酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢、半乳糖代谢以及嘌呤代谢通路产生延缓肾间质纤维化的协同保护作用。综上所述，大黄酸和姜黄素联用后可以在体内及体外共同通过调节脂质标志物水平(MG(0∶0/20∶3(11Z,14Z,17Z))、LysoPE(0∶0/18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z))、PC(18∶0/20∶3(5Z,8Z,11Z))、α-亚麻酸和二十二碳六烯酸)，参与脂质代谢途径(甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成途径)对肾间质纤维化产生协同保护作用。
论文的第三部分，利用实验构建肾间质纤维化分子网络模型，模拟大黄酸和姜黄素联用的协同延缓肾间质纤维化作用机制。首先，在分子水平上，构建了大黄酸和姜黄素干预的肾成纤维细胞的分子网络常微分方程(Ordinary differential equation,ODE)模型，模拟两者联用对肾间质纤维化进程的延缓作用。结果显示，10ng/mL转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor，TGF-β1)刺激下较1ng/mL TGF-β1明显出现纤维化症状。在5ng/mL大黄酸干预下，TGF-β1、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、细胞周期蛋白(Cyclin)、ɑ-平滑肌肌动蛋白(ɑ-SMA)和白介素-6(IL-6)浓度明显降低，同时出现滞后现象；5μM姜黄素干预时TGF-β1、ECM、MCP-1、Cyclin、ɑ-SMA和IL-6浓度较10ng/mLTGF-β1刺激时有所下降，纤维化程度降低但效果较大黄酸干预时不明显；当5ng/mL大黄酸和5μM姜黄素联合刺激时，各物质浓度较大黄酸或姜黄素单用时更为减少，与第一部分中的实验结果一致，佐证了大黄酸和姜黄素联用对体外肾间质纤维化的协同保护作用。大黄酸和姜黄素联用时可能通过直接作用于MAPK、NF-κB和JAK/STAT3信号通路从而间接刺激TGF-β/Smad信号通路对肾间质纤维化产生协同保护作用。