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生物钟是生物适应地球自然光热环境周期性变化而形成的内在计时机制,能够保持机体生理功能与外界环境之间的协调。生物钟系统紊乱会导致机体的功能失衡,引发代谢和免疫失衡、睡眠和消化障碍、心血管疾病等严重问题。由于生物钟系统调控的生理功能的复杂性和广泛性,人类所关注的生物钟对内分泌激素和免疫系统的调控机制还不清楚。到目前为止,还没有找到生物钟与内分泌、生物钟与免疫系统连接的关键基因或者通路。本文利用中国特色的无脊椎模式动物家蚕,构建了生物钟隐花色素基因(BmCry1)敲除的稳定遗传突变体(Cry1-/-),进一步研究其内分泌-生长发育系统和先天免疫-免疫抵抗性的调控机制。(1)成功构建了家蚕生物钟核心基因BmCry1敲除的稳定遗传突变体利用TALEN敲除技术,注射蚕卵1440粒,孵化率16.60%;G1代通过酶切检测基因组DNA,筛选到包括缺失、替换和插入类型的BmCry1基因杂合突变体,突变率41.18%。通过自交世代连续测序选择,在G5代获得2个纯合的BmCry1基因突变体,即插入7 bp并伴有6 bp替换的ACry1-1和缺失4bp的ΔCry1-2。基因转录和翻译水平验证,结果ΔCry1-1的mRNA和蛋白质都不表达;ΔCry1-2虽未检测到蛋白质、但有低水平的mRNA。对ΔCry1-1经过连续10世代的基因组检测,证明获得了稳定的BmCry1基因完全敲除突变体,本文简称为Cry1-/-。以经典的生物钟光周期控制的孵化节律表型检验,显示Cry1-/-家蚕卵的孵化不能被LD循环光所诱导,孵化分散,昼夜节律相位改变、节律丧失。孵化行为发生前后,Cry1-/-家蚕卵中孵化样酶和几丁质酶等与孵化行为密切相关的酶蛋白活性和基因转录水平,以及调控内分泌激素的脑神经肽BmPtth基因、主要内分泌保幼激素和蜕皮激素的受体基因的时间表达谱,都出现了与孵化一致的昼夜节律相位改变。时间差异转录组学分析显示,Cry1-/-家蚕卵中,比野生型WT卵出现了最高达2616个差异表达基因。GO分析和KEGG分析显示,差异表达基因的功能变化不仅与孵化行为相关的蛋白酶类,还聚焦于调控内分泌激素的脑激素和主要内分泌激素的多个受体,甚至复杂的糖代谢、脂质代谢和蛋白质代谢的调控。显示Cry1-/-家蚕不仅生物钟负反馈信号系统信号输出作用发生了改变,还引发了更加复杂的基因组表达重编程。(2)生物钟基因BmCry1对家蚕内分泌激素的调节机制准确测定家蚕世代中最易受内分泌影响的幼虫和蛹期发育速度变化,结果Cry1-/-家蚕虽然幼虫眠中变态发育经过时间没有变化,但幼虫和蛹期发育变慢、经过时间显著延长了 73 h。比较突变体与野生型家蚕幼虫的体重、摄食量、消化量及饲料效率,显示Cry1-/-家蚕发育变慢不是由于幼虫食物摄入和消化吸收降低导致的。聚焦脑-前胸腺(Br-PG)协调的脑神经肽-内分泌固醇激素(PTTH-20E)合成与分泌调控对发育速度的影响。免疫组化结果显示,Cry1-/-家蚕的脑神经分泌细胞CNCs合成PTTH速度变慢,输送释放组织咽侧体CA中的PTTH积累速度减慢;PG中MH合成相关酶的基因表达下调,5龄幼虫末期的血淋巴蜕皮激素活化形式20E滴度峰值出现推迟,代谢组织脂肪体中蜕皮激素的受体基因和信号传导成员的基因表达峰出现延迟。蛋白质Co-IP研究发现,家蚕BmCRY1不能与PTTH结合。CHIP-seq调查也发现BmCYCLE和BmCLOCK蛋白不能直接调控BmPtth基因的转录,但BmCYCLE能直接调控保幼激素(JH)生物合成关键基因BmJhamt以及蜕皮激素受体的表达;BmCLOCK能调控家蚕素和神经肽受体A16等基因的转录活性。进一步在Cry1-/-家蚕脑中发现,BmPtth和BmJhamt的转录水平与BmClock和BmCycle基因一样被显著抑制。结论是,敲除家蚕BmCry1基因,通过生物钟转录因子BmCYCLE和BmCLOCK调控保幼激素JH的合成酶BmJhamt的基因转录,以及可能调节蜕皮激素受体、家蚕素和神经肽的基因转录,反馈抑制或间接影响Ptth和MH的表达。CNCs-CA-PG分泌系统中,PTTH和MH的合成和分泌受到抑制,导致家蚕幼虫发育延迟,但没有出现发育障碍。(3)敲除生物钟基因BmCry1降低家蚕免疫抵抗性的先天免疫调控机制为了评估生物钟基因BmCry1缺失对机体的先天免疫系统影响,本文首先调查了 Cry1-/-家蚕的生存能力变化。与野生型WT家蚕相比,虽然Cry1-/-家蚕在环境良好的春季饲养存活率没有显著差异,但在夏秋季饲养存活率显著低于WT,对高温抵抗性也显著变差,感染S.aureus后存活率更低,血淋巴中载菌量更高。未染菌时的转录组分析发现,敲除生物钟基因BmCry1后,家蚕代谢和免疫组织脂肪体中基因表达上调表达287个、下调表达909个,GO和KEGG分析显示其脂质代谢、TCA循环和糖代谢等能量代谢途径受到抑制。qRT-PCR测定进一步证明Cry1-/-家蚕显著下调了 TCA循环的限速酶基因BmCs、BmIdh和BmOgdh表达。染菌S.aureus发病死亡前病菌潜伏和发病前期的时间转录组分析发现,染菌后6 h和24 h出现了DEGs非常显著高于其它时点的基因转录风暴。野生型家蚕体内包括肽聚糖识别蛋白(PGRPs)和6种主要抗菌肽(AMPs)基因,也在染菌后6h和24 h显著上调表达;Cry1-/-家蚕虽然出现了更加剧烈的基因转录风暴,但多个免疫相关基因的表达上调水平显著低于WT。基于时间转录组学分析节律基因数量、振荡类型、振幅和表达水平模式,发现敲除BmCry1家蚕节律基因的模式变化类似于染菌后的WT,28个免疫节律基因的表达峰值分布显示其免疫系统紊乱。结论是,敲除家蚕生物钟基因BmCry1,导致节律基因表达模式改变,先天免疫紊乱;TCA循环和脂质代谢水平下调所致的能量供应降低;染菌后抗菌关键节点转录因子风暴的表达大面积改变,其免疫响应显著区别于野生型家蚕,导致免疫抵抗性下降。