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布鲁氏菌病是一种人畜共患传染病,布鲁氏菌感染患者出现波浪热、关节炎、心内膜炎和脑膜炎等症状,感染动物出现流产和不育,造成巨大的经济损失和重大的公共卫生负担。布鲁氏菌外膜蛋白（Outer membrane protein,Omp）在细菌感染和致病过程中发挥了重要的作用,根据分子量大小分为3组,目前研究较多的共有6个。布鲁氏菌IV型分泌系统（Type IV secretion system,T4SS）是由vir B操纵子编码,目前已经鉴定出的依赖于T4SS的效应蛋白共有15个。布鲁氏菌可引起机体免疫抑制,但是关于布鲁氏菌Omps和T4SS效应蛋白抑制先天免疫的作用及机制尚不完全清楚。本研究首先筛选可明显抑制干扰素-β（interferon-β,IFN-β）产生的Omps和T4SS效应蛋白。然后,检测筛选得到的蛋白对DNA病毒诱导的IFN-β及下游干扰素刺激基因（interferon stimulate genes,ISGs）转录的影响,接着检测这些蛋白对DNA病毒诱导的IFN-β产生和对cGAS-STING信号通路的影响,确定其作用信号通路的靶分子及作用方式,检测它们与信号通路靶分子的互作情况,并对直接互作的蛋白进行截短,然后检测这些截短体与信号通路中靶分子互作的结合域。接着检测外膜蛋白和T4SS效应蛋白截短体对DNA病毒诱导的IFN-β转录和产生的影响,确定抑制IFN-β产生的功能结合域。最后,缺失功能结合域和突变功能结合域中关键氨基酸位点,检测缺失体和突变体对IFN-β转录和产生及对cGAS-STING信号通路的影响。研究结果旨在探究布鲁氏菌Omps和T4SS效应蛋白抑制DNA病毒诱导的IFN-β产生的作用及机制,为进一步探讨布鲁氏菌引起机体免疫抑制机制提供理论依据。研究取得以下结果。1.布鲁氏菌Omp25、Bsp B和RicA抑制ifn-β的启动子活性以灭活的牛种布鲁氏菌基因组DNA为模板,构建了牛布鲁氏菌主要外膜蛋白和T4SS效应蛋白的慢病毒表达载体,酶切和测序鉴定结果显示,以上各蛋白慢病毒表达载体构建成功。将各蛋白慢病毒表达载体质粒与PMD2.G和ps PAX2共转染293T细胞,将收集的慢病毒液感染RAW264.7细胞,结果发现,Omps和T4SS效应蛋白在RAW264.7细胞中表达,并筛选出布鲁氏菌Omp25、Bsp B和RicA可极显著抑制ifn-β启动子活性（P＜0.01）。2.Omp25与cGAS互作,通过泛素蛋白酶体途径降解cGAS,抑制IFN-β产生的机制Lv-Omp25可极显著抑制DNA病毒诱导的IFN-β的转录和表达以及ISGs的转录（P＜0.01）,明显促进PRV和HSV-1病毒的复制。Lv-Omp25可明显抑制STING和IRF3的磷酸化水平和IRF3的入核（P＜0.01）,并通过泛素蛋白酶体途径降解cGAS,明显抑制cGAS的酶活性（P＜0.01）。进一步试验发现,Omp25与cGAS互作,Omp25（161-184 aa）与cGAS（161-522 aa）是其互作的关键结合域;Omp25（161-184 aa）是抑制DNA病毒诱导的IFN-β转录和表达的关键结合域。缺失aa 161-184后,Omp25Δ161-184对DNA病毒诱导的IFN-β转录、表达及cGAS活性的抑制作用明显减弱（P＜0.05）;Omp25Δ161-184对HSV-1诱导的p-STING、p-IRF3和cGAS表达的抑制作用明显减弱（P＜0.05）。突变Omp25（161-184 aa）第176、180位精氨酸和179、181、184位酪氨酸,结果发现,Omp25-5M对DNA病毒诱导的IFN-β转录、表达及cGAS活性的抑制作用明显减弱（P＜0.05）;Omp25-5M对HSV-1诱导的p-STING、p-IRF3和cGAS表达的抑制作用明显减弱（P＜0.05）。3.RicA与STING互作,通过自噬溶酶体途径降解STING,抑制IFN-β产生的机制Lv-RicA可极显著抑制DNA病毒诱导的IFN-β转录和表达以及ISGs的转录（P＜0.01）,明显促进PRV和HSV-1病毒的复制,Lv-RicA组中PRV和HSV-1的病毒DNA拷贝数极显著升高（P＜0.01）。Lv-RicA可明显抑制TBK1、IRF3的磷酸化水平和通过自噬溶酶体途径降解STING。进一步试验发现,RicA与STING互作。将RicA和STING进行截短发现,RicA（1-88 aa）与STING（1-153 aa）是其互作的关键结合域;RicA（1-88 aa）可极显著抑制IFN-β的转录和表达（P＜0.01）。分段缺失RicA 1-88 aa,结果显示,RicAΔ1-20对ifn-β启动子活性明显减弱（P＜0.05）,并对DNA病毒诱导的IFN-β转录及表达水平的抑制作用明显减弱（P＜0.05）;对HSV-1诱导的TBK1与IRF3磷酸化水平的抑制作用减弱（P＜0.05）。突变RicA 1-20 aa第4,6位酪氨酸和第16位精氨酸,结果发现,RicA-3M对DNA病毒诱导的IFN-β转录和表达的抑制作用明显减弱（P＜0.05）;并对HSV-1诱导的p-TBK1和p-IRF3的抑制作用明显减弱（P＜0.05）。4.Bsp B与TBK1竞争性结合IRF3,减少TBK1对IRF3的磷酸化和p-IRF3的入核,抑制IFN-β产生的机制Lv-Bsp B可极显著抑制DNA病毒诱导的IFN-β转录和表达以及ISGs的转录（P＜0.01）,Lv-Bsp B组中PRV和HSV-1病毒DNA拷贝数极显著升高（P＜0.01）。进一步研究发现,Bsp B作用于cGAS-STING的靶位点是IRF3。Lv-Bsp B可明显抑制DNA病毒诱导的IRF3的磷酸化和p-IRF3的核转移（P＜0.01）。进一步试验发现,Bsp B与IRF3互作。将Bsp B和IRF3进行截短发现,Bsp B（156-187 aa）和IRF3（198-427aa）是其互作的关键结合域;Bsp B（156-187 aa）可极显著抑制DNA病毒诱导的IFN-β转录和表达（P＜0.01）。缺失Bsp B（156-187 aa）,发现Bsp BΔ156-187对DNA病毒诱导的IFN-β转录和表达的抑制作用减弱（P＜0.05）;Bsp BΔ156-187对HSV-1诱导IRF3磷酸化的抑制作用明显减弱（P＜0.05）。Lv-GFP和Lv-Bsp B分别感染RAW264.7,结果发现,Bsp B与TBK1竞争性结合IRF3,减少TBK1对IRF3的磷酸化,减少核转录因子IRF3。突变Bsp B aa 156-187第179,181,183和184位精氨酸,结果显示,Bsp B-4M对DNA病毒诱导的IFN-β转录和表达的抑制作用明显减弱（P＜0.05）;对HSV-1诱导的IRF3磷酸化和p-IRF3入核的抑制作用明显减弱（P＜0.05）。本研究成功构建了布鲁氏菌主要Omps和依赖于T4SS效应蛋白慢病毒表达载体,从中筛选到明显抑制ifn-β启动子活性的Omp25、Bsp B和RicA。发现了Omp25（161-184 aa）、RicA（1-20 aa）和Bsp B（156-187 aa）是布鲁氏菌Omp25、RicA和Bsp B抑制IFN-β产生的功能结合域。研究结果阐明了布鲁氏菌Omp25、RicA和Bsp B抑制DNA病毒诱导IFN-β产生的作用和调控机制,为深入研究布鲁氏菌致病机制提供理论依据。