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背景:肿瘤治疗过程中形成的化疗药物以及小分子靶向药物等的耐药仍然是当前卵巢癌等恶性肿瘤治疗中尚未解决的难题。卵巢癌细胞中常常发生的基因突变,会导致不同的患者对化疗药物、小分子靶向药物等敏感性不同。目前认为,这其中除了基因突变,肿瘤细胞为了应对外在的、内在的应激所启动的适应性应激反应也可能导致抗肿瘤药物耐药的主要原因之一。当肿瘤细胞受到化疗药等刺激时,细胞发生应激反应,磷酸化的真核起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2A,eIF2α）作为应激反应的关键节点因子,能够通过维系适应性应激反应重建蛋白稳态,从而导肿瘤细胞的抗肿瘤药物敏感性下降。最近研究发现磷酸化的eIF2α通过破坏帽依赖翻译的启动迅速抑制mRNA的翻译,造成大量未翻译的mRNA、RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）和信使核糖核蛋白体（messenger ribonucleoprotein,m RNP）,从而在胞浆聚集形成应激颗粒（stress granules,SGs）。SGs能够快速调节细胞内mRNA翻译的变化,也能通过募集信号分子参与信号传递,所以应激颗粒的形成在维系适应性应激反应中发挥着重要作用。因此,探究磷酸化eIF2α介导的应激颗粒形成能够为进一步阐明肿瘤细胞抵抗药物作用机制提供新的启发。PI3K/mTOR通路在卵巢癌增殖中中发挥着重要作用,因此,作为小分子靶向药物PI3K/mTOR双靶向抑制剂的抗肿瘤效果引起了关注。卵巢癌细胞依据PI3K/mTOR通路相关蛋白是否过度活化等基因变异,对PI3K/mTOR双靶向抑制剂的作用效果不同,但是其下游分子机制不十分清楚。线粒体作为感知和缓解压力的主要细胞器也参与了肿瘤细胞适应性应激反应,抑制mTOR通路会影响线粒体的相关蛋白翻译,引起线粒体应激,从而激活线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfold protein response,mt UPR）,其中启动mt UPR的关键信号分子为ATF5。虽然尚未见mt UPR与SGs之间的相关实验研究,但有研究指出,当应激颗粒存在时,会对线粒体相关蛋白的翻译进行调控。所以我们猜测SGs作为细胞的防御机制可能通过对信号分子ATF5定位的改变,进而调控mt UPR,使得线粒体功能增强,最终导致肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性增强。以上提示我们从全新角度探讨分子靶向药物作用机制具有更加重要的意义。目的:检测卵巢癌细胞通路应激颗粒的形成,确定应激颗粒与双靶向抑制PI3K/mTOR剂敏感性的关系;分析应激颗粒对mt UPR形成的影响,阐明应激颗粒调控mt UPR拮抗PI3K/mTOR双靶向抑制剂的作用机制。方法:1.对卵巢癌细胞A2780和SKOV3,使用不同浓度的PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402处理24 h,MTT检测两种细胞的细胞活性,并选取2.5μM药物浓度进行后续实验;Western blot实验对相关凋亡蛋白进行检测。2.经PKI-402（2.5μM）处理12 h和24 h,用Western blot检测A2780和SKOV3细胞中ATF5、应激关键蛋白p-eIF2α并验证PI3K/mTOR双靶向抑制剂的抑制效果。3.经PKI-402（2.5μM）处理12 h,免疫荧光检测应激颗粒标志性蛋白YB-1和G3BP1的共定位,观察细胞内是否有应激颗粒形成。4.经PKI-402（2.5μM）处理12 h,分离线粒体和胞浆,用Western blot法检测线粒体未折叠蛋白反应相关蛋白表达。流式细胞术检测线粒体膜电势以及细胞内的活性氧（ROS）,以此来评价线粒体功能。5.经PKI-402（2.5μM）处理12 h,使用应激颗粒标志蛋白G3BP1进行免疫共沉淀实验;分离细胞核蛋白与胞浆蛋白,用Western blot检测ATF5是否进入细胞核。6.加入放线菌酮（5μg/ml）45 min,抑制应激颗粒的形成,然后再用不同浓度的PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402处理24 h,再次检测细胞对双靶向抑制剂的敏感性。7.加入放线菌酮（5μg/ml）45 min,再加入PKI-402（2.5μM）,Western blot检测细胞中ATF5,应激关键蛋白p-eIF2α以及PI3K/mTOR的下游蛋白的表达变化;分离线粒体和胞浆,Western blot检测线粒体未折叠蛋白反应相关蛋白酶和分子伴侣的蛋白表达变化;流式细胞术检测线粒体膜电势以及细胞内的ROS,观察线粒体功能的变化。结果:1.与SKOV3卵巢癌细胞相比,A2780卵巢癌细胞反而对PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402不敏感,且A2780细胞内有明显的抗凋亡现象。2.在PKI-402的作用下,在A2780细胞内,应激相关蛋白表达水平均显著升高。3.在PKI-402的作用下,A2780细胞内发现有应激颗粒形成。4.在PKI-402的作用下,分离A2780线粒体蛋白和胞浆蛋白,线粒体未折叠蛋白反应被激活,相关的蛋白酶和分子伴侣的蛋白表达水平增加,并且线粒体膜电势升高,ROS减少,线粒体功能增强。5.对A2780细胞内有应激颗粒进一步研究发现ATF5与应激颗粒标志蛋白G3BP1存在相互作用;分离A2780细胞核蛋白和胞浆蛋白,ATF5有明显入核的现象。6.应激颗粒形成被抑制后,A2780细胞对PKI-402的敏感性增加。7.应激颗粒抑制后,在PKI-402的作用下,应激相关蛋白表达下降。进一步分离线粒体蛋白和胞浆蛋白,线粒体未折叠蛋白反应的相关蛋白表达下降,线粒体膜电势下降,ROS增多,线粒体功能减弱。结论:1.与卵巢癌SKOV3细胞相比,A2780对PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402却不敏感,可能与A2780细胞eIF2α发生磷酸化导致应激颗粒形成有关。2.卵巢癌A2780细胞线粒体未折叠蛋白反应增强线粒体功能可能是导致PI3K/mTOR双靶向抑制剂PKI-402不敏感的主要原因之一。3.卵巢癌A2780细胞形成的应激颗粒通过改变信号因子ATF5的定位可能是导致A2780细胞对PKI-402不敏感的主要机制。