便秘是全球范围内常见的胃肠功能紊乱表现之一。其反复发生不仅影响患者的健康,而且严重影响患者的生活质量,并带来一定的经济负担。大黄味苦、性寒,泻下通便力强,能荡涤胃肠积滞,素有“将军”之称,为治疗积滞便秘的要药。虽起效快,效果好,但是大黄性峻猛,应用不当会影响肠道水电解质平衡,导致肠道损伤,引起不良反应。临床上常用甘草与大黄配伍,不仅可缓和大黄的峻下作用,还能减轻其不良反应,如《金匮要略》中所载大黄甘草汤即为两药配伍用于治疗便秘的经典方剂。国内外许多学者对大黄配伍甘草前后的物质基础和作用机制进行研究,但目前尚不完全清楚,尤其是作用机制方面更有待深入探究。《景岳全书》中记载大黄“通水道”,而水分子通过水通道蛋白主体中的水孔进出细胞,可实现水在细胞内外的大量快速转运,提示通过水通道蛋白跨细胞途径的水分吸收可能具有重要的意义。肠道中的微生物区系可将大黄中不被吸收的番泻苷A转化为真正的泻下活性成分来发挥泻下作用,表明肠道菌群与肠道功能密不可分。故推测大黄峻下以“水”为核心介质,以“肠”为主要作用部位。因此,本研究拟从水通道蛋白和肠道菌群的角度对大黄配伍甘草前后的效毒变化及作用机制进行探索研究,以揭示甘草缓和大黄峻烈之性的内在本质,为中医临床安全合理应用大黄-甘草配伍提供科学依据。本论文共分为三章,各章的研究内容及结果如下:第一章文献研究第一节基于肠道动力和水液电解质转运的便秘发病机制研究进展排便是一个复杂的生理过程,受多种因素影响。本节对便秘的作用机制进行了概述,包括影响肠道动力、水液转运以及电解质转运（吸收和分泌）的作用机制,还总结了不同药物治疗便秘的作用机制。为进一步研究甘草缓大黄峻烈之性的作用机制提供了重要支撑。第二节甘草缓大黄峻烈之性的认识和研究进展药性理论是中医药理论体系的核心组成部分,也是指导临床使用中药和阐释中药作用机制的重要依据。有着“国老”美誉的甘草,因其药性和缓,是中医方剂中发挥调和作用的首选药物;而素有“将军”之称的大黄,其药性峻烈,虽为泻下良药,使用不当却会对机体造成损伤。大黄-甘草临床配伍应用已有数千年历史,甘草以其“调和”之性缓大黄峻烈之力,不仅可缓和大黄的泻下作用,还能减轻其不良反应。本节基于药性理论阐释了甘草缓大黄峻烈之性的传统认识,综述了大黄-甘草配伍后的物质基础、药物代谢、肠道动力、水液代谢、肠道菌群及免疫调控的现代研究进展,以期为甘草缓大黄峻烈之性的深入研究提供依据,同时为阐明甘草“调和”之性的科学内涵提供研究思路。第三节研究思路与方案设计本节旨在说明课题研究思路、论文设计及研究内容的整体框架。围绕大黄-甘草配伍,以积滞便秘为疾病模型,拟解决以下主要科学问题:（1）从水通道蛋白角度揭示大黄峻下导致的水液代谢失衡及配伍甘草后的作用;（2）从肠道菌群角度明确了大黄对肠道微生物稳态的影响及配伍甘草后的作用。最终为揭示甘草缓和大黄峻烈泻下所致肠道毒副作用的生物学机制提供思路与方法的探索,为中医临床大黄-甘草配伍应用的安全有效提供科学依据。第二章大黄泻下作用及肠道毒副反应研究第一节大黄对便秘模型的泻下作用及肠道损伤评价本节建立小鼠积滞便秘模型,给以枸橼酸莫沙必利作为阳性药物,给以不同剂量大黄（1.95、3.9、7.8、15.6 g/kg）进行干预。以小鼠粪便含水量、粪便数量和粘液便数量考察大黄对积滞便秘小鼠的泻下作用。收集十二指肠、空肠、回肠和结肠组织,通过肠道病理切片初步评价大黄峻下所引发的肠道损伤。结果表明大黄在1.95、3.9、7.8 g/kg剂量下可通过增加粪便数量和粪便含水量来发挥泻下作用,而当大黄的剂量达到15.6 g/kg（临床用量120g）时,则对肠道表现出明显的毒性,即15.6 g/kg（临床用量120g）剂量下大黄在发挥泻下作用的同时会造成肠道黏膜炎症细胞浸润及肠上皮细胞缺失等病理性损伤。第二节大黄对便秘模型水通道蛋白表达及调控机制的影响采用q RT-PCR及Western Blot技术研究不同剂量大黄对结肠AQPs表达的影响,筛选关键AQPs。结果表明在结肠主要的AQPs亚型AQP1、AQP3、AQP7、AQP8和AQP11中,大黄能够随着剂量的增加显著下调小鼠结肠AQP3和AQP8的表达。提示大黄可能通过降低AQP3和AQP8表达从而发挥泻下作用。采用Western Blot进一步分析调控AQP3的短时调节关键信号通路VIP/c AMP/PKA通路中VIP、c AMP、PKA、p-PKA、CREB、p-CREB的表达。研究表明大黄可通过调节VIP/c AMP/PKA途径下调结肠中AQP3 m RNA和蛋白表达来发挥泻下功能。第三节大黄对便秘模型肠道菌群的影响本节采用16S r DNA测序技术分析了不同剂量大黄对便秘小鼠肠道菌群的影响。结果表明,1.95 g/kg（临床用量15g）大黄干预后使得小鼠肠道菌群和正常组接近。而大黄随给药剂量的增加显著降低了便秘小鼠肠道菌群多样性和物种丰度,且15.6 g/kg（临床用量120g）剂量大黄能够明显造成肠道菌群失衡,表现为部分有益菌减少（如乳酸杆菌）和致病菌增加（如肠杆菌）。揭示适宜剂量的大黄对便秘小鼠肠道菌群紊乱有明显的改善作用,而大黄剂量过高反而会造成肠道菌群严重失调。第三章大黄配伍甘草后缓解肠道毒副作用的研究第一节大黄配伍甘草前后体外化学成分含量变化研究本节采用高效液相色谱法测定大黄-甘草中17个化学成分的含量变化,开展大黄配伍甘草前后体外化学成分研究。结果发现大黄-甘草合煎对不同类型的化学成分含量有不同程度的影响。第二节大黄配伍甘草前后对便秘模型肠道毒副反应的比较研究本节建立积滞便秘小鼠模型,研究甘草对不同剂量大黄“泻下攻积”效应及毒副作用的影响,系统评价大黄与甘草配伍后的缓和作用。观察便秘小鼠排便特征和肠道病理学改变,结果显示低剂量大黄与甘草配伍能减缓其泻下作用,包括减少粪便含水量和粪便数量,但减缓的程度并不显著;15.6 g/kg（临床用量120g）剂量的大黄与甘草配伍能显著减轻大黄所致的肠道毒性（减轻炎症细胞浸润及肠上皮细胞缺失程度）,肠道病理评分趋于正常。表明甘草对大黄的缓和作用随着大黄剂量的增加而加强。第三节基于水通道蛋白的甘草缓大黄峻下作用机制研究本节研究大黄与甘草配伍前后对便秘模型小鼠结肠组织中关键AQPs的调节作用。分析大黄-甘草配伍前后AQP3和AQP8的表达,结果表明甘草可调节大黄导致的AQP3和AQP8表达水平的降低,且以15.6 g/kg（临床用量120g）剂量下缓和作用最为明显。初步阐明了甘草可能通过对AQP3和AQP8的调控修复大黄泻下峻猛所致的肠道水液代谢失衡。通过转录组学技术对C组、M组、DD组和GD组的小鼠结肠组织进行高通量测序,筛选DD组与GD组的差异表达基因,随后对差异表达基因进行聚类分析、GO分析和KEGG通路富集分析。研究结果表明,DD组与GD组共有1254个差异表达基因,其中显著上调的基因有571个,显著下调的基因有683个。这些差异表达基因富集主要与TNF信号通路,PPAR信号通路和蛋白质的消化和吸收有关。转录组学分析发现,AQP8、H19、NLRP3在AQPs参与甘草缓大黄峻烈之性的过程中发挥重要作用。第四节基于肠道菌群的甘草缓大黄峻下作用机制研究本节研究大黄与甘草配伍前后肠道菌群的变化,从肠道菌群的角度揭示甘草缓和大黄的峻烈作用。研究结果表明,各配伍组大黄及大黄-甘草小鼠的肠道菌群多样性低于模型组,且15.6 g/kg（临床用量120g）剂量下,甘草可以缓和大黄所致的菌群多样性降低,且配伍甘草后可以调节大黄导致的乳酸杆菌减少和拟杆菌增多。揭示甘草可以调节大黄导致的肠道菌群紊乱,维持菌群稳定。