研究背景和目的:肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）,也称肾癌,是全世界最常见的恶性肿瘤之一。据统计,2020年预计新诊断肾脏及肾盂肿瘤73750例,约占总体癌症诊断的4%。根治性手术是早期肾癌的主要治疗手段。但是,由于早期肾癌缺乏特异性的症状,患者往往会错过早期诊断和治疗的机会。多达30%的肾癌患者在初次就诊时就已经发生了转移。目前,早期肾癌患者的5年总生存率可达93%,而转移性肾癌患者的5年总生存率仅为12%。此外,由于肿瘤的高度异质性,一些临床常用的风险指标,如年龄、TNM分期等,对患者预后的评估并不准确。因此,深入研究肾癌发生和进展的机制,寻找一些新的可靠的肾癌预后评估指标和潜在的治疗靶点,对于帮助肾癌的早期诊断和治疗,改善肾癌患者的预后具有非常重要的意义。近年来,随着转录组学和蛋白质组学的普及,生物数据量呈井喷式增长。为充分挖掘这些高通量数据的潜在价值,生物信息学技术得到了快速发展。在肿瘤学领域,生物信息学已在筛选差异基因、鉴定肿瘤生物标志物、建立肿瘤预后模型等方面得到了广泛应用。本研究拟通过转录组学和蛋白质组学方法对肾癌发生过程中的表达谱进行研究,鉴定肿瘤生物标志物并开发新的预后评估手段,为肾癌患者的风险分层和个体化治疗提供指导。本研究将分为三部分内容:一、通过定量蛋白质组学技术对肾癌肿瘤组织和癌旁对照组织中的全蛋白质表达谱进行初步分析,研究肾癌发生过程中的蛋白失调情况及相关分子通路变化;二、联合转录组学和蛋白质组学方法筛选与肾癌的发生和预后密切相关的生物标志物并建立预后模型;三、根据转录组学和蛋白组组学分析结果,筛选出一个肾癌的关键基因IGF2BP3,通过分子生物学实验对该基因在肾癌发生过程中的功能及潜在的分子生物学机制进行初步研究。1肾细胞癌定量蛋白质组学研究研究方法:本研究采集了四例在本中心泌尿外科确诊并进行手术治疗的肾癌患者的肿瘤组织和癌旁对照组织样本。提取组织样品蛋白后,使用胰酶将蛋白裂解成肽段。使用串联质谱标签（Tandem Mass Tag,TMT）的方法标记肽段,通过液相二级质谱（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer/Mass Spectrometer,LC-MS/MS）技术对肽段进行鉴定和定量。使用Swiss Prot Human数据库对肽段进行检索并注释后,根据|log2FC|≥0.8和P＜0.05的筛选标准提取肾癌肿瘤组织和癌旁对照组织之间的差异蛋白。接着,使用基因本体数据库（Gene Ontology,GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）对差异蛋白进行功能富集分析。研究结果:本项研究一共鉴定到300个在肾癌组织和癌旁对照组织中的差异蛋白。其中,在肿瘤中表达上调的蛋白165个,在肿瘤中表达下调的蛋白135个。根据差异倍数进行排序发现,FABP7、IGF2BP3、NNMT、NEFL和THBS2是上调差异最大的五个蛋白质,MUC13、CKMT1A、UMOD、CALML3和S100A2是下调差异最大的五个蛋白质。GO富集分析结果提示上调差异蛋白主要与细胞粘附能力调节和免疫反应激活的生物过程有关,下调差异蛋白主要与氧化还原过程、小分子分解与代谢、一元羧酸代谢有关。KEGG通路富集分析提示差异蛋白参与氧化磷酸化、氨基酸代谢、碳代谢等多条代谢相关通路。其中,氧化磷酸化等是富集最显著的通路。研究结论:本研究通过肾癌的定量蛋白质组学分析发现肾癌发生过程中主要与氧化还原过程减弱、小分子代谢减弱、离子转运减弱、细胞粘附能力增强和免疫反应激活等生物过程相关。此外,研究发现代谢相关通路失调是肾癌发生过程中的一个重要特征。2基于转录组学和蛋白质组学的肾细胞癌预后模型构建研究方法:从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库下载肾癌的全转录组测序数据,以|log2FC|≥0.8和P＜0.05的标准筛选肾癌组织和癌旁对照组织之间的差异m RNA。将差异m RNA与差异蛋白取交集获得在RNA转录水平和蛋白翻译水平均存在差异的基因进行研究。通过单因素Cox回归鉴定与肾癌总生存期（overall survival,OS）显著相关的基因,使用套索（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator,Lasso）回归和多因素Cox回归构建肾癌预后模型。使用Kaplan-Meier生存分析、接受者操作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线等方法在对预后模型的预测效能进行评估。使用多因素Cox回归检验预后模型预后评估能力的独立性,并基于临床风险指标和预后模型构建肾癌预后评估的列线图。使用校正曲线对列线图预测效能进行检验。使用ROC曲线比较列线图、预后模型和临床常用风险指标的预后评估能力。最后,通过Connectivity Map（CMap）数据库对高风险组患者的靶向小分子药物进行筛选。研究结果:本研究共鉴定得到212个在RNA转录水平和蛋白翻译水平均存在显著差异的基因。单因素Cox回归发现91个基因与肾癌患者预后显著相关。使用Lasso回归和多因素Cox回归筛选出六个关键基因SH3BGRL3、IGF2BP3、NRBP2、LAD1、HOGA1和SMIM24,并构建了一个肾癌预后模型。Kaplan-Meier生存分析提示预后模型能很好地区分不同预后的肾癌患者（P＜0.0001）。ROC曲线提示预后模型具有较高的预后评估准确性,预测模型对肾癌患者1年、3年、5年生存预测的曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为0.790、0.739和0.749。多因素Cox回归发现,预后模型是肾癌预后的独立风险因素。校正曲线显示基于预后模型和临床风险指标构建的列线图能较好地评估肾癌患者的预后情况。ROC曲线提示列线图的预后评估效能优于临床常用的风险指标。此外,CMap数据库的药物筛选结果显示,依昔舒林可能是针对高风险组患者最有潜力的小分子药物。研究结论:基于转录组学和蛋白质组学构建的预后模型和列线图能较准确地预测肾癌患者的预后情况,对临床工作中肾癌患者的风险分层和预后评估具有一定的指导作用。同时,依昔舒林可能是高风险组患者的候选药物之一。3 IGF2BP3在肾细胞癌中的功能及分子机制研究研究方法:使用生物信息学方法分析肾癌中IGF2BP3的表达水平。使用荧光定量PCR（Quantitative Reverse Transcription PCR,q RT-PCR）实验和Western Blot实验验证肾癌组织和肾癌细胞系中IGF2BP3的表达特征。使用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和流式细胞术探究IGF2BP3对肾癌细胞增殖能力和细胞周期的影响。使用三维培养实验探究IGF2BP3对肾癌肿瘤血管拟态（vasculogenic mimicry,VM）生成的影响。使用Western Blot实验探究IGF2BP3调控肾癌增殖能力和VM形成的可能机制。研究结果:IGF2BP3在肾癌中高表达,且与患者OS和无病生存期（disease free survival,DFS）显著相关。CCK-8实验、细胞克隆形成和三维培养实验提示,敲低IGF2BP3水平会降低肾癌细胞的增殖活力、克隆形成和VM形成能力,过表达IGF2BP3会增强肾癌细胞的增殖活力、克隆形成和VM形成能力。流式细胞实验提示,敲低IGF2BP3可以引起肾癌细胞发生G0/G1期阻滞,过表达IGF2BP3可以促进肾癌细胞从G0/G1期转化为S期。Western Blot实验证明敲低IGF2BP3表达水平引起细胞周期蛋白CDK4和Cyclin D1及VM相关蛋白MMP9和Vimentin蛋白水平下降。进一步的分子机制探究发现,IGF2BP3可以参与PI3K/AKT信号通路的激活,调控肾癌的进展。研究结论:IGF2BP3在肾癌高表达并与患者预后相关,是肾癌重要的生物标志物。功能试验发现,IGF2BP3可以调控肾癌细胞的细胞周期和VM形成。进一步分子生物学研究发现,IGF2BP3可以参与肾癌细胞中PI3K/AKT信号通路的激活,调控肾癌细胞的进展。