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大菱鲆（Scophthalmus maximus）作为一种从欧洲引进的名贵低温海水鱼类,具有极高的商业价值。其对温度等环境指标要求较严,尤其是高温胁迫会使鱼体产生应激反应,从而导致死亡率升高,生长速度和抗病力下降等现象。因此对大菱鲆的耐温性状进行遗传改良,选育出生长性能优良的耐高温新品种已成为健康养殖的当务之急[1]。在鱼类抗逆性状选育工作中,耐热性能评估指标较为单一,也造成耐高温选育评价体系不完善,分子标记少,且效率较低等等问题,因此开展热胁迫分子机理研究对于筛选高效的分子（基因）标记具有重要意义。心脏是脊椎动物胚胎发育过程中第一个形成并发挥作用的器官,对于维持机体稳态发挥关键作用[2]。高温环境下心脏应对热应激的功能是鱼类设定上限热范围的重要因素,心脏可塑性的分子机制的研究可解决海洋变暖影响鱼类的生理和分布问题,因此本论文以大菱鲆心脏为研究对象,开展了热应激下大菱鲆心肌损伤及细胞凋亡的影响探究,同时利用二代测序技术构建大菱鲆心脏高温转录组数据库;基于课题组之前的QTL定位及心脏等多个组织的转录组学研究发现,p53在大菱鲆热应激中发挥非常关键的作用,以p53信号通路为研究靶点探究p53基因及其两个关键调控基因（mdmx、ube2h）的功能,对大菱鲆热应激分子机制研究提供数据参考及理论基础。具体研究结果如下:1.大菱鲆作为一种低温适应冷水性经济鱼类,高温环境下严重影响其生长生存。该章为解析热应激对大菱鲆心脏损伤及其机制,从组织形态、生理生化反应及凋亡基因表达多个水平,开展相关研究。共设计3个温度点:14±0.5℃(常温、24±0.5、28±0.5℃;2个时间点:12h、24h。结果显示:随着温度升高,心肌纤维肿胀,断裂,间质宽度增加,炎细胞浸润,线粒体结构破坏等组织损伤现象加重,但在24℃-24h时组织损伤明显减轻;肌酸激酶（creatine kinase,CK）活性随着热应激加剧显著升高;乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LD或LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量在24℃时达到峰值,表明大菱鲆遭受到热应激,心肌防御酶发挥抵抗作用,维持机体稳态。qPCR显示,大菱鲆心肌细胞Bax基因和Caspase-3基因变化趋势一致,随着热应激的加剧,表达量降低,而Bcl-2基因逐渐升高;表明在热应激程度较轻时,大菱鲆心肌通过降低Bax、Caspase-3基因表达,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达减少心肌细胞丢失来减少热应激损伤;当热应激加剧至28℃时,热应激超过自身生理调节阈值,损伤加重,机体防御系统自身也受损,造成大菱鲆心脏结构严重损伤甚至机体死亡。结果表明随着温度升高,大菱鲆心肌损伤加重,机体通过调节心肌防御酶活性以及细胞凋亡最大限度维持稳态减少组织损伤,超过24℃,则会造成机体损伤不可逆转地持续加重。本章为后续大菱鲆及其他鱼类心脏对热应激的生理适应性机制研究提供理论基础,同时为海洋鱼类耐高温性状选育提供更多的性状指标,提高选育精确性。2.为探索大菱鲆耐高温的分子机制,筛选耐高温相关基因,本研究利用RNA-seq技术分别对4个不同温度处理组（14℃、20℃、24℃、28℃）的大菱鲆心脏进行转录组测序,并进行生物信息学分析,包括DEGs鉴定,GO基因功能注释、KEGG富集通路分析,qPCR验证差异表达基因,挖掘心脏在热应激下的潜在调控基因。获得的主要结果如下:产生611,375,686条原始序列和592,822,038条有效序列,使用层次聚类的热图分析来确定不同组中的DEGs分布。根据GO术语,基因分布在生物过程,细胞成分和分子功能中超过50多个类别。3,214个基因包括891个基因在生物过程（BP）中,1059个基因在细胞组件（CC）中,1264个基因在分子功能类别（MF）中。使用KEGG数据库进行途径富集分析,共有437、1128、2001、368、1071和683个基因被富集在不同路径中。在热应激后,共有34条途径显著富集（P<0.05）,包括遗传信息过程,代谢,人类疾病,细胞过程。其中“内质网（ER）中的蛋白质加工”是极其显著富集通路,该通路共富集了70个基因。其他信号通路包括“DNA复制”,“脂质代谢”,“氨基酸代谢”,“细胞生长与死亡”和“心血管疾病”。在课题组建立肾脏转录组数据库之后,本研究建立了大菱鲆心脏高温转录组数据库,为大菱鲆高温胁迫分子机理研究及筛选遗传标记提供了丰富的数据参考[3]。3.基于课题组之前的QTL定位及多个组织的转录组学研究发现,p53在大菱鲆热应激中发挥非常关键的作用,同时泛素蛋白酶体途径富集其中,因此我们选择p53主要负调控基因mdmx,及泛素蛋白酶体关键基因ube2h开展基因功能研究。研究结果表明机体内p53基因的稳定性和活性受泛素化的严格调控。（1）mdmx基因功能研究结果如下:通过RT-PCR及RACE技术克隆得到Sm-mdmx基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析。采用qPCR技术测定Sm-mdmx的组织表达及在肝脏,心脏组织中的4个热应激温度点（14℃、20℃、24℃、28℃）的表达变化。并通过RNA干扰技术检测Sm-mdmx及Sm-p53在肝脏,心脏组织中,在常温及热应激下在基因mdmx被敲低后6h、12h、18h的转录水平。大菱鲆mdmx基因c DNA序列全长为1623bp。其中3′UTR区域含有典型的加尾信号AATAAA和poly A尾。该基因ORF可编码一个由388个氨基酸残基组成的蛋白质,相对分子质量为56.61kDa,理论等电点为4.54。大菱鲆与牙鲆、罗非鱼在进化关系上聚为一支,与鱼类亲缘关系最近。Sm-mdmx在脾脏中最高而在肾中最低。Sm-mdmx和p53在mdmx干扰后在正常温度条件下表现出拮抗作用,但在热应激下心脏中显示出协同作用,推测mdmx和p53信号传导途径之间存在互作关系,且mdm2与mdmx之间微妙的互相作用也影响p53水平的表达变化需进行下一步探究。（2）ube2h基因功能研究结果如下:根据之前团队克隆得到的ube2h通过RT-PCR检测Sm-ube2h的组织表达及在热应激下肝脏,心脏组织中的4个温度点（14℃、20℃、24℃、28℃）的表达变化。并通过RNA干扰技术检测Sm-ube2h及Sm-p53在肝脏,心脏组织中,在常温及热应激下在基因ube2h被敲低后6h、12h、18h的转录水平。Sm-ube2h在脾脏中含量最高,在心脏,鳃和大脑中含量较高,而在肝脏和肾脏中含量较低。热应激下肝脏中Sm-ube2h的表达随应激时间的延长而增加,最高值出现在28℃。虽然心脏的水平也从14℃升高,但当温度达到24℃和28℃时,未观察到明显差异。Sm-ube2h和p53在ube2h干扰后在正常温度条件下表现出拮抗作用,但在热应激下显示出协同作用,推测泛素蛋白酶E2和p53信号通路之间存在互作关系。研究结果表明,在大菱鲆中p53基因受泛素化相关基因ube2h和mdmx调控,且mdmx表达可能有组织差异性。mdm2-mdmx-p53共同作用维持机体稳态。综上所述,本研究探究了热应激下大菱鲆心脏损伤及细胞凋亡的影响,确定了心脏的热敏性,进而通过心脏高温转录组测序筛选到p53的两个关键调控基因mdmx、ube2h进行克隆,表征分析及功能验证,初步证实大菱鲆p53基因的表达受负调节剂mdmx和泛素耦联酶ube2h的调控,泛素化调控Sm-p53基因的稳定在响应大菱鲆热应激的过程中具有重要意义。我们的结果提高了我们对大菱鲆热耐受性分子机制的理解,为阐明Sm-p53基因和泛素蛋白酶体途径相关基因在大菱鲆机体热应激响应的分子机理提供理论依据。