论文部分内容阅读
目的探讨胰岛素诱导低血糖对新生大鼠海马神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖和分化的影响。材料和方法1、新生大鼠低血糖模型的制作新生1d大鼠禁食24h,腹腔注射胰岛素50u·kg-1,血糖值<1.0 mmol·L-1处死。2、神经干细胞的培养无菌分离脑海马组织,在含碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）和B27的DMEM/F12无血清培养基中进行原代培养。原代培养细胞大多数克隆球直径达到200μm时,0.25%胰蛋白酶37℃消化5min,加入10%胎牛血清终止消化,1000r·min-1离心5min,吸管反复吹打,进行传代培养。3、神经干细胞的诱导分化及鉴定分别取原代和传3代的细胞（克隆球直径达到200μm）,利用有限稀释法进行单克隆培养。单细胞克隆培养形成的克隆球直径达到200μm时,0.25%胰蛋白酶37℃消化5min,加入10%胎牛血清终止消化,1000r·min-1离心5min,吸管反复吹打。将各组细胞分别接种于涂布多聚赖氨酸的六孔板中,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导分化4h,对一部分细胞行巢蛋白（Nestin）免疫细胞荧光染色;5d后对另一部分细胞分别行神经元特异性烯醇化酶（neurone specific enolase,NSE）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和半乳糖脑苷酯（galactocerebroside,GalC）免疫细胞荧光染色,对神经干细胞进行鉴定。各组分别于100倍镜下随机选取6个视野,计数NSE阳性细胞比例,进行统计学分析。实验结果1、神经干细胞的鉴定结果单细胞克隆增殖的细胞表达Nestin,诱导分化的细胞表达NSE、GFAP和GalC。2、胰岛素诱导低血糖对神经干细胞增殖及分化影响的结果（1）原代组培养的细胞与原代对照组相比生长较快;传代组培养的细胞与传代对照组生长速度相同;单细胞克隆培养结果与原代及传代培养结果相同。（2）原代对照组、原代组、传代对照组及传代组神经干细胞分化为神经元的比例分别为12.64±2.04%、16.85±2.36%、13.34±2.36%、13.82±2.19%。统计学结果表明:原代组细胞诱导分化为神经元的比例明显高于对照组和传代组（P<0.05）;传代组细胞诱导分化为神经元比例与对照组无显著性差异（P>0.05）。结论胰岛素诱导低血糖能够短暂地促进新生大鼠海马神经干细胞增殖及向神经元分化。