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2013年,中国首次报告了人感染H7N9禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的病例,截至2022年6月,H7N9AIV已感染1568人,导致616人死亡,病死率较高（http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/en/empres/H7N9/situationupdate.html）。H7N9 AIV不仅严重危害了养禽业的发展,而且影响了人类健康。因此需要一种高度安全和有效的疫苗来预防H7N9AIV的潜在的大流行。接种疫苗一直是预防流感的最主要途径,多价灭活苗是目前人用流感疫苗的最常用的流感疫苗。灭活疫苗的缺陷主要在于过敏反应引发的安全性问题和很难提供持久的免疫保护。病毒样颗粒（Virus-like Particles,VLP）包含了较高密度的抗原蛋白,能够像天然病毒一样有效的进入到细胞,具有很好的免疫原性和安全性。此外,VLP可低成本快速生产的特点也是应对潜在的流感大流行发生时的优势。糖基化是一种常见的翻译后修饰,在蛋白质生物学功能中起着重要作用。糖基化修饰也是病原体遮蔽自身表位,进行免疫逃避的重要方式。因此,通过改变抗原基序,增加或删除潜在的糖基化修饰,增强疫苗的免疫原性以开发新型疫苗成为了疫苗研究的新手段。本研究评估了利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的H7N9亚型流感病毒VLP疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护效力;构建了三株HA糖基化修饰位点改变的重组杆状病毒,并制备了相应的VLP疫苗,评估了不同的HA糖基化修饰组合VLP疫苗对SPF鸡和BALB/c小鼠的免疫保护效力。实验结果表明,对SPF鸡和BALB/c小鼠,所有VLP疫苗组均可提供针对高致病性H7N9AIV 100%的临床保护。其中,133和158双糖基化修饰的VLP疫苗显著提升了实验动物的体液免疫应答、减轻了肺脏的病理变化、显著减少了小鼠肺脏中炎性细胞因子的分泌,为新型H7N9流感疫苗的设计提供了参考。1.H7N9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗对小鼠的免疫效果评估本研究利用本实验室前期构建的表达H7N9亚型AIV的HA、NA和M1基因的重组杆状病毒 rBac-GD15-HA、rBac-GD15-NA和 rBac-GD15-M1 共感染 Sf9细胞,制备了 H7N9 VLP疫苗,并对疫苗进行了纯化处理。分别以纯化和未纯化的H7N9 VLP疫苗对4周龄BALB/c小鼠进行免疫:免疫程序为第一次免疫后3周进行加强免疫;免疫剂量为单次10μg;免疫途径为肌肉注射。结果发现,加强免疫后第2周,疫苗组均可诱导小鼠产生高效的血凝抑制（HI）抗体、病毒中和（VN）抗体和IgG抗体。用S8/H7N9鼠适应株进行攻毒保护实验,PBS组小鼠出现了明显的体重下降,在8天内全部死亡;而两组疫苗均可提供100%的临床保护,且可以完全抑制病毒在小鼠组织器官内的复制。小鼠肺脏中T细胞免疫相关细胞因子和炎性细胞因子的检测结果显示,VLP疫苗显著提升了小鼠肺脏组织中IL-2、IL-4和IFN-γ的基因表达水平,且显著抑制了 IFN-1β、IL-6、TNF-α、MIP-1α、IFN-γ、RANTES、IP-10等细胞因子的表达。其中纯化组VLP疫苗效果更佳。肺脏组织病理切片结果表明,疫苗组均有效地减轻了免疫小鼠感染病毒后的肺损伤。综上所述,本研究制备的H7N9 VLP疫苗,通过两次免疫,对小鼠提供了针对致死剂量的高致病性H7N9病毒的100%的临床保护,显著减少了肺脏的组织损伤,为后续构建糖基化修饰模式改变的H7N9VLP疫苗提供了基础。2.38/133/158位HA糖基化修饰对H7N9亚型禽流感VLP疫苗免疫原性的影响为探究糖基化修饰对H7N9亚型禽流感VLP疫苗免疫原性的影响,本实验构建了三个糖基化修饰相关基序改变的流感病毒HA序列,成功拯救了重组杆状病毒 rBac-GD15-HA-38（-）、rBac-GD15-HA-133（+）158（+）和 rBac-GD15-HA-133（+）158（-）。以三个突变重组杆状病毒为HA蛋白供体,制备了相应的VLP:VLP-38（-）,VLP-133（+）158（+）和 VLP-133（+）158（-）。结果发现 VLP-133（+）158（+）组抗原产量最高。分别设计了 SPF鸡和BALB/c小鼠的动物实验。SPF鸡实验结果表明,VLP-133（+）158（+）组疫苗可以诱导SPF鸡在单次免疫后的第2周快速产生显著高于WT组的HI抗体。用GD15病毒进行攻毒保护实验,发现在14天观察期内各疫苗组的SPF鸡均未出现临床症状和死亡,而PBS对照组的鸡出现明显的流感临床特征,在7天内全部死亡。说明VLP疫苗均给SPF鸡提供了针对H7N9HPAIV的100%的临床保护。组织病毒载量测定的结果表明,各组VLP疫苗都能完全抑制病毒在组织器官内的复制。针对BALB/c小鼠实验结果表明,在两次免疫后,VLP-133（+）158（+）组疫苗可以诱导小鼠产生显著高于WT组的HI抗体和VN抗体。用S8/H7N9鼠适应株进行攻毒保护实验,PBS组小鼠出现了明显的体重下降,在8天内全部死亡,而疫苗组小鼠均未出现体重下降和死亡。组织病毒载量测定的结果表明,各组VLP疫苗均能完全抑制病毒在组织器官内的复制。小鼠肺脏中T细胞免疫相关细胞因子和炎性细胞因子的检测结果显示,VLP-133（+）158（+）组疫苗显著提升了 IL-2、IL-4的表达量;各VLP组疫苗均显著抑制了 IFN-1β、IL-6、TNF-α、MIP-1α、IFN-γ、RANTES、IP-10 等细胞因子的表达,其中VLP-133（+）158（+）组抑制TNF-α和MIP-1α和RANTES表达的效果最佳。综上所述,本研究通过构建了三个HA糖基化修饰位点改变的重组杆状病毒,并成功组装了 VLP,制备了疫苗。研究发现,VLP-133（+）158（+）双糖基化修饰组抗原产量显著提升;且在SPF鸡和BALB/c小鼠的免疫保护实验中,VLP-133（+）158（+）双糖基化修饰组,产生了显著高于其他组的体液免疫应答效果,显著减轻了 SPF鸡肺脏的病理变化、显著减少小鼠肺脏中炎性细胞因子的分泌。这些结果表明,糖基化修饰在设计新型禽和哺乳动物流感疫苗方面有一定的潜力。