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骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种慢性代谢性骨骼系统疾病,以全身或局部骨量降低,骨骼微结构破坏以及骨骼脆性增加为主要临床表现。目前,基于双能X射线的全身或局部骨密度（bonemineral density,BMD）检测已成为界范围所公认的OP诊断金标准。由于OP发生的隐匿性和由此导致BMD降低的不可逆性,早期诊断对于预防和治疗OP具有重要的临床和公共卫生意义。外泌体作为一种细胞外囊泡,其内部可以包裹多种具有生物活性的核酸分子,例如microRNAs（miRNAs）,message RNAs（mRNAs）,long non-coding RNAs（lncRNAs）等。当发生疾病或处于病理状态下,外泌体中各种成分的组成可发生明显的改变。既往研究表明外泌体miRNAs参与介导细胞与细胞之间信息传递,从而调控细胞内不同目的基因表达,进而与多种疾病的发生发展密切相关。基于以上研究背景,本研究包括两部分。第一部分对OP患者血浆外泌体差异表达miRNAs进行筛选,并选择其中存在差异表达的外泌体miR-130a-3p在较大规模人群中进行验证,确认血浆外泌体miR-130a-3p在OP患者和健康对照之间的差异表达情况;第二部分通过细胞和动物实验研究外泌体miR-130a-3p对成骨细胞表型及其对卵巢切除（ovariectomy,OVX）骨质疏松小鼠骨密度的影响,揭示外泌体miR-130a-3p参与OP的分子机制。第一部分研究目的通过以社区为基础的骨质疏松流行病学随访研究,对骨质疏松患者血浆外泌体差异miRNAs进行初步筛选,并在较大样本人群中进行独立验证。针对初筛和验证存在差异表达的血浆外泌体miRNAs,对该miRNAs的血浆表达水平进行检测。研究方法所有参与随访调查研究的老年人群均采集有关生物标本（血浆和尿液）,并使用双能X射线对研究参与者腰椎（L1-L4）和髋部（股骨颈和髋部）进行骨密度测量。考虑到骨质疏松症发病的性别差异,本研究采用极端取样的原则,从所有参与调查的人群中分别挑选出100例极低髋部骨密度和100例极高髋部骨密度的老年女性。排除疾病和其他因素的影响,按照年龄匹配的原则从上述极端人群中随机选取18例,包括9例低骨密度和9例高骨密度。分别将低骨密度组和高骨密度组的血浆样本进行混样预处理（每3个样本混合为1个样本）,提取血浆外泌体并进行初筛检测。针对初筛具有统计差异的外泌体miRNAs,在标本库中分别挑选年龄匹配的30例低髋部骨密度和30例高髋部骨密度老年女性标本进行初步验证。为获得更加稳定的研究结果,又选取独立的100例低髋部骨密度和100例高髋部骨密度老年女性,对初筛和初步验证后存在差异的外泌体miRNAs进行二次独立验证。针对具有初筛和二次验证具有统计学差异的血浆外泌体miRNAs,在二次验证标本中随机选取72例高骨密度和72例低骨密度标本,检测该miRNAs在血浆中的表达水平。研究结果miRNAs芯片初步筛选结果发现15条差异表达的血浆外泌体miRNAs,后续两次独立样本验证结果发现miR-130a-3p的表达水平在老年女性骨质疏松患者血浆外泌体中显著升高,且差异均具有统计学意义（均有P＜0.05）。同时对血浆miR-130a-3p的表达水平进行检测,结果发现老年女性骨质疏松患者血浆miR-130a-3p水平也呈现明显升高。通过对血浆外泌体miR-130a-3p和血浆游离miR-130a-3p与不同部位骨密度进行关联分析,结果发现血浆外泌体miR-130a-3p的CT值分别与股骨颈骨密度（r=0.204,P=0.003）和髋部骨密度（r=0.298,P=0.000）的T值之间呈正相关,而血浆miR-130a-3p的CT值只与髋部骨密度（r=0.191,P=0.021）的T值呈现正相关。提示血浆外泌体和血浆中miR-130a-3p的高表达与骨密度的降低有关。研究结论1 老年女性骨质疏松患者血浆外泌体miR-130a-3p与血浆游离miR-130a-3p表达水平均较健康对照呈现明显升高。2老年女性骨质疏松患者血浆外泌体miR-130a-3p表达水平与股骨颈和髋部骨密度相关,血浆miR-130a-3p水平只与髋部骨密度相关。血浆与血浆外泌体miR-130a-3p水平升高,骨密度降低。第二部分研究目的基于第一部分的研究发现,针对miR-130a-3p进行细胞和动物水平研究。探究miR-130a-3p对成骨细胞（MC3T3-E1）表型的影响,通过对卵巢切除术（ovariectomy,OVX）模拟骨质疏松小鼠模型注射miR-130a-3p的类似物（AgomiR-130a-3p）或抑制物（AntagomiR-130a-3p）,检测OVX小鼠骨密度改变情况。此外,通过对miR-130a-3p的靶基因进行预测和验证,部分阐明miR-130a-3p参与骨质疏松发生发展的分子机制。研究方法借助脂质体转染 AgomiR-130a-3p 或 AntagomiR-130a-3p 进入 MC3T3-E1 细胞,以实现细胞内miR-130a-3p水平的升高和降低,qRT-PCR对成骨细胞分化标志物mRNA表达水平进行检测,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）细胞染色观察MC3T3-E1细胞分化情况,明确miR-130a-3p对成骨细胞分化的作用。CCK8试剂盒用于检测升高和降低miR-130a-3p对MC3T3-E1细胞增殖的影响,分别使用细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒对细胞凋亡和细胞周期变化情况进行检测。动物实验使用C57BL/6雌性小鼠构建OVX骨质疏松小鼠模型。分别对16周龄OVX小鼠和正常小鼠（WT）的血浆外泌体进行提取,qRT-PCR检测血浆外泌体miR-130a-3p水平;此外,通过分离小鼠不同部位的组织/器官（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、主动脉血管组织、骨骼肌组织和骨髓）,检测不同组织/器官miR-130a-3p的表达水平,并结合已有外泌体miRNAs数据库确认血管内皮细胞可能作为miR-130a-3p的来源细胞。收集血管内皮细胞细胞系（b.END）细胞培养液,提取外泌体,使用荧光膜染料（PKH67）标记b.END细胞外泌体,并加入至MC3T3-E1细胞培养基中,观察b.END细胞分泌的外泌体是否可以被MC3T3-E1细胞内吞。采用过表达miR-130a-3p的慢病毒转染 b.END 细胞（LV-miR-130a-3p b.END）,以获得高表达 miR-130a-3p 的 b.END细胞外泌体。LV-miR-130a-3pb.END细胞与MC3T3-E1细胞共培养,并使用外泌体分泌抑制剂（GW4869）处理后,检测成骨细胞细胞分化标志物mRNA的变化情况。采用适配体纳米复合物包裹AgomiR-130a-3p或AntagomiR-130a-3p以模拟外泌体的部分功能,并通过尾静脉注射进入小鼠体内。注射结束后,分离小鼠股骨并使用显微CT（MicroCT）对小鼠股骨骨密度进行检测。miR-130a-3p调控靶基因预测和验证,采用miRNA数据库对miR-130a-3p调控的靶基因进行预测,qRT-PCR和Western Blot（WB）分别对miR-130a-3p调控靶基因的mRNA水平和蛋白表达情况进行检测,双荧光素报告基因检测miR-130a-3p与靶基因的结合情况。研究结果脂质体转染 AgomiR-130a-3p 和 AntagomiR-130a-3p 后,MC3T3-E1 细胞内miR-130a-3p水平分别呈现显著升高和降低,高表达的miR-130a-3p可以抑制MC3T3-E1细胞中成骨分化标志物ALP,Ⅰ型胶原（collagentype Ⅰ,Coll）,骨钙素（osteocalcin,OCN）和 Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）的mRNA表达,升高骨桥蛋白（osteopontin,OPN）的水平（均有P＜0.05）。而降低MC3T3-E1细胞中miR-130a-3p水平后,成骨分化标志物ALP,Coll,OCN和Runx2的mRNA表达水平呈现显著上升（P＜0.05）。MC3T3-E1细胞分别转染AgomiR-130a-3p和AntagomiR-130a-3p并培养7天后,ALP染色结果显示AgomiR-130a-3p组染色较AgomiR NC组颜色较浅,而AntagomiR-130a-3p组较AntagomiR NC组染色结果稍深,该结果进一步支持miR-130a-3p具有抑制成骨细胞分化的作用。细胞增殖检测发现AgomiR-130a-3p可以抑制MC3T3-E1细胞的增殖。此外,流式细胞术对不同转染组（AgomiR-130a-3p/AgomiRNC 和 AntagomiR-130a-3p/AntagomiRNC）的细胞凋亡率检测后,结果发现AgomiR-130a-3p可以诱导MC3T3-E1细胞凋亡,而AntagomiR-130a-3p则对细胞凋亡情况无明显影响。细胞周期测定结果发现,AgomiR-130a-3p和AntagomiR-130a-3p对MC3T3-E1细胞细胞周期并无显著影响。此外,还发现MC3T3-E1细胞分化不同时间段内,其细胞内miR-130a-3p呈现出明显下降趋势。上述结果表明,高表达的miR-130a-3p能够抑制成骨细胞增殖、诱导细胞凋亡,并且对成骨细胞的分化具有显著的抑制作用。OVX小鼠血浆外泌体miR-130a-3p水平相较于WT小鼠显著升高,这与第一部分中在老年女性骨质疏松人群中的发现是一致的。此外,还发现OVX小鼠的脾脏、肺、骨髓组织、主动脉血管内皮组织和肝脏组织中miR-130a-3p表达较WT小鼠显著升高,结合已有外泌体数据库中的分析结果,将外泌体miR-130a-3p的来源细胞锁定为血管内皮细胞。通过提取并标记小鼠血管内皮细胞（b.END）上清液中外泌体,并将其与MC3T3-E1细胞培养,发现b.END细胞分泌的外泌体可以顺利被MC3T3-E1内吞。慢病毒过表达miR-130a-3p转染b.END细胞,发现LV-miR-130a-3p b.END细胞培养上清液中外泌体miR-130a-3p较LV-NC b.END细胞显著升高。采用细胞共培养（上层细胞分别为LV-miR-130a-3pb.END或LV-NC b.END,下层细胞均为MC3T3-E1细胞）,通过加入外泌体抑制剂GW4869和其溶剂对照DMSO后,结果发现 LV-miR-130a-3p b.END/MC3T3-E1+DMS组 MC3T3-E1 细胞中 ALP,OCN和Runx2的mRNA水平较其他比较组均呈现显著下降,该结果表明外泌体miR-130a-3p亦对成骨细胞分化起抑制作用。OVX小鼠模型随机分为4组,分别注射适配体包裹的AgomiR-130a-3p/AgomiR NC或AntagomiR-130a-3p/AntagomiRNC,通过小鼠股骨骨密度测量发现,AgomiR-130a-3p组股骨骨密度较AgomiR NC组出现明显下降;相较于AntagomiR NC组,AntagomiR-130a-3p组小鼠股骨骨密度呈现出显著回升。该结果表明,高表达的miR-130a-3p 水平可以加重OVX小鼠的骨丢失,而抑制和降低miR-130a-3p 水平则可以部分逆转和升高OVX小鼠的骨密度。通过RNA数据库对miR-130a-3p的靶基因进行预测,并从中选取与骨代谢过程有关的靶基因 Estrogen receptor 1（ESR1）、Transforming growth factor beta receptor 1（TGFBR1）和 TGFBR2 进行 qRT-PCR 和 WB 验证,结果发现 AgomiR-130a-3p 可以抑制上述靶基因的mRNA水平和蛋白表达,而AntagomiR-130a-3p则可以升高上述靶基因的mRNA和蛋白表达。双荧光素报告基因证实miR-130a-3p可以与靶基因ESR1、TGFBR1 和 TGFBR2 结合。研究结论1 miR-130a-3p可能通过抑制成骨细胞的增殖和分化、诱导成骨细胞凋亡降低骨生成,导致骨质疏松的发生。2 OVX小鼠血浆外泌体miR-130a-3p水平较对照小鼠也呈现显著升高3外泌体miR-130a-3p可能来源于血管内皮细胞,且血管内皮细胞来源的外泌体可以被成骨细胞内吞。4血管内皮细胞外泌体高表达miR-130a-3p也具有抑制成骨细胞分化的作用。5 AgomiR-130a-3p可进一步降低OVX小鼠骨密度,AntagomiR-130a-3p可以逆转和提升OVX小鼠的骨密度,抑制miR-130a-3p可能作为骨质疏松治疗的潜在靶点。6 miR-130a-3p可能通过抑制ESR1、TGFBR1和TGFBR2基因表达参与骨质疏松症的发生发展过程