【摘 要】
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棉花是重要经济作物和纤维作物,是纺织工业必需的原材料,棉花产业的发展具有无可替代的战略地位。在转基因抗虫棉培育与商业化之前,以棉蚜、棉铃虫、棉叶螨和棉红铃虫四大害虫对棉花的危害最为严重。随着Bt抗虫棉的广泛种植与田间农药用量的大幅度减少,在棉铃虫危害得到了有效防治的同时,非靶标害虫棉蚜虫、盲蝽蟓类、烟粉虱类等数量显著增加,渐渐上升成为棉田的主要害虫,尤其是盲蝽蟓类昆虫,给棉花的产业发展造成了重大的
【基金项目】
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国家自然科学基金“创新研究群体项目”“棉花种质创新和高产分子育种”（项目编号:31621005）的部分研究成果，课题主持人:李付广研究员（中国农业科学院棉花研究所）；
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棉花是重要经济作物和纤维作物,是纺织工业必需的原材料,棉花产业的发展具有无可替代的战略地位。在转基因抗虫棉培育与商业化之前,以棉蚜、棉铃虫、棉叶螨和棉红铃虫四大害虫对棉花的危害最为严重。随着Bt抗虫棉的广泛种植与田间农药用量的大幅度减少,在棉铃虫危害得到了有效防治的同时,非靶标害虫棉蚜虫、盲蝽蟓类、烟粉虱类等数量显著增加,渐渐上升成为棉田的主要害虫,尤其是盲蝽蟓类昆虫,给棉花的产业发展造成了重大的损失。绿盲蝽是棉田常见的主要盲蝽类害虫,危害严重,由于缺乏合适的抗绿盲蝽品种,目前解决虫害的主要方式是在棉花生长过程中持续喷施化学杀虫剂,增加种植成本的同时也对环境造成了不利影响。本研究通过对Cry51Aa1基因进行定向改造,获得了抗绿盲蝽的Cry51Aa1.C006基因,通过遗传转化棉花验证了其功能,筛选得到了抗绿盲蝽的棉花纯合株系材料。主要研究结果如下:1.本研究通过定点突变技术对已有原蛋白基因Cry51Aa1进行了定向改造,从而得到了 6个新的突变蛋白基因Cry51Aa1.C005、Cry51Aa1.C006、Cy51Aa1.C007、Cry51Aa1.C008、Cry51Aa1.C009相Cry51Aa1.C010。之后构建了Cry51Aa1和6个突变基因的原核表达载体,表达和提取了原蛋白以及6个新的突变蛋白。然后通过绿盲蝽饲喂对突变的蛋白进行体外毒力试验,结果表明,其中Cry51Aa1.C006突变蛋白对绿盲蝽具有很强的毒杀效果,其它5个突变蛋白对绿盲蝽也有一定的效果,但是与Cry51Aa1.C006突变蛋白相比效果不明显。2.根据上述筛选结果,然后,通过农杆菌介导方法将Cry51Aa1和Cry51Aa1.C006基因转化到陆地棉品种中棉所24中,经过硫酸卡那霉素和PCR鉴定,最终获得了 11个纯合的转化体材料。然后对转基因材料不同组织（叶片、茎、生长的茎端与幼蕾）提取RNA,进行qRT-PCR实时定量分析,结果表明11个转化体材料中Cry51Aa1.C006基因表达量在不同组织均高倍量表达。抗虫鉴定表明,11个转化体材料中的2个转化体Cry51Aa1.C006-10-13和Cry51Aa1.C006-10-61对绿盲蝽的抗性表现最强。农艺性状和品质性状分析结果表明,与受体材料中棉所24相比,转Cry51Aa1.C006基因材料的株高、结铃数和果枝数显著增加,第一果枝长度、单铃重、衣分和纤维品质（纤维长度、比强度、伸长率、马克隆值和整齐度）无显著变化。3.通过对上述筛选到的抗虫效果好的转化体Cry51Aa1.C006-10-13和Cry51Aa1.C006-10-61进行Southern blot分析,结果表明,2个转化体均为单拷贝插入;然后通过Genome walking方法进行侧翼序列鉴定,结果表明,Cry51Aa1.C006-10-13转化体的插入位点位于D12号染色体的63328845-63329028位间,替换掉D12号染色体的63328845-63329028位间182bp的碱基序列,Cry51Aa1.C006-10-61转化体的插入位点位于A13号染色体的32939476-32939524位间,替换掉A13号染色体的32939476-32939524位间47bp的碱基序列。
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