目的:1.构建Spred-1基因flox纯合且Cre阳性和Spred-1基因flox纯合且Cre阴性小鼠。2.制备并评价咪喹莫特改良型造模方法诱导的C57BL/6J小鼠银屑病模型,以获得时间更为持久、病理特征更为典型的银屑病样小鼠模型。3.通过对银屑病样小鼠Spred-1基因条件性敲低的研究,寻找Spred-1蛋白参与银屑病发生、发展的确切证据。4.通过清血毒颗粒合剂对Spred-1基因敲低银屑病样小鼠模型的干预作用,探讨基于Spred-1/ERK通路是否是其治疗银屑病的可能机制。方法:1.应用受精卵同源重组的方式,进行flox修饰Spred-1基因;在Krt14基因起始密码子位点定点敲入Cre ERT2-wpre-p A表达框,构建Krt14-（Cre ERT2）杂交小鼠;通过以下两种方法进行小鼠繁殖:一种方法是将获得的Spred-1基因flox和Cre双阳性杂交小鼠与flox杂交小鼠交配;另一方法是将获得的Spred-1基因flox和Cre双阳性杂交小鼠与Spred-1基因flox纯合小鼠交配。2.将C57BL/6J小鼠随机分为正常组（涂抹凡士林）和改良组[涂抹咪喹莫特乳膏+皮下注射重组小鼠白细胞介素12和脂多糖（每周1次）],连续14 d,每组8只。实验观察C57BL/6J小鼠的PASI评分变化以及皮肤组织的病理结构变化、脾指数。3.将32只小鼠随机分为4组,分别为:将非可诱导性Spred-1基因条件性敲低小鼠[Spred-1（+）Cre（-）,Spred-1+/-]分为玉米油组（对照1组）及他莫昔芬组（对照2组）各8只;将可诱导性Spred-1基因条件性敲低小鼠[Spred-1（+）Cre（+）,Spred-1+/+]分为玉米油组（对照3组）及他莫昔芬组（实验4组）各8只。实验开始,Spred-1+/-玉米油组（对照1组）及Spred-1+/+玉米油组（对照3组）腹腔注射玉米油（剂量120mg/kg/mouse）,Spred-1+/-他莫昔芬组（对照2组）及Spred-1+/+他莫昔芬组（实验4组）腹腔注射他莫昔芬（剂量120mg/kg/mouse）,隔日1次,共5次。基因诱导敲低注射后,进行小鼠背部脱毛开始造模,四组小鼠均定时涂抹咪喹莫特乳膏外搽+皮下注射重组小鼠白细胞介素12（rm IL-12）和脂多糖（每周1次）],连续14天后处死取样。实验观察小鼠PASI评分变化、皮损组织病理情况;同时进行Western blot和RT-PCR实验观察银屑病样小鼠非/近皮损区、皮损区中Spred-1蛋白和皮损区中Ras/ERK信号通路相关蛋白及m RNA表达。4.将32只小鼠随机分为4组,分别为:Spred-1+/-清血毒颗粒组（对照5组）8只;Spred-1+/+清血毒颗粒组（实验6组）、Spred-1+/+复方青黛胶囊组（对照7组）、Spred-1+/+模型组（模型8组）各8只。分别于实验第0天,第10天,第24天进行剪尾检测Spred-1基因表达情况。实验第一天,Spred-1+/-清血毒颗粒组（对照5组）、Spred-1+/+清血毒颗粒组（实验6组）、Spred-1+/+复方青黛胶囊组（对照7组）、Spred-1+/+模型组（模型8组）均腹腔注射他莫昔芬（剂量120mg/kg/mouse）,隔日1次,共5次。实验第11天（造模前1天）,进行小鼠背部脱毛。实验第12天（造模第1天）,四组小鼠均每日定时涂抹咪喹莫特乳膏外搽+皮下注射重组小鼠白细胞介素12（rm IL-12）和脂多糖（每周1次）进行造模;同时,从实验第17天（造模第5天）开始,每日对照5组及实验6组给予清血毒颗粒合剂灌胃,对照7组给予复方青黛胶囊灌胃,模型8组给予生理盐水灌胃,连续14天后,处死取样。此外,在实验过程中,观察小鼠PASI评分;实验结束后,观察小鼠皮肤组织病理,并进行Western blot及RT-PCR实验观察清血毒颗粒合剂对银屑病样小鼠皮损区Spred-1/Ras/ERK通路上相关蛋白及m RNA的表达。结果:1.先获得Spred-1基因flox杂合子小鼠与Krt14-（Cre ERT2）杂合子小鼠;最终获得Spred-1基因flox阳性且Cre阳性小鼠24只,以及Spred-1基因flox阳性且Cre阴性小鼠40只。2.通过应用改良型方法对银屑病样小鼠模型进行构建,发现造模后的银屑病样小鼠模型PASI评分、病理Baker评分、脾指数较正常组相比,有统计学意义（P＜0.001）,说明改良型方法诱导的银屑病样小鼠模型较成功,可实现银屑病样小鼠模型14日造模效果。3.在Spred-1基因敲低实验中,通过Western blot和RT-PCR实验,我们发现实验4组小鼠体内非/近皮损区及皮损区Spred-1蛋白及m RNA表达降低,与对照1、对照2及对照3组相比有显著差异（P＜0.001）,说明他莫昔芬成功诱导构建了Spred-1基因敲低小鼠;而对照1、对照2及对照3组组间比较无显著差异（P＞0.05）,且他莫昔芬注射非可诱导条件性基因敲低小鼠后,非/近皮损区及皮损区Spred-1蛋白及m RNA表达均未见降低,说明他莫昔芬对非可诱导条件性基因敲低小鼠Spred-1表达无影响。4.在Spred-1基因敲低实验中,对照1、对照2及对照3及实验4四组小鼠均从造模后第2-3天可见到淡红斑、细薄鳞屑;第4天起,出现红色斑片、鳞屑成层,逐渐加重;于第9天开始,皮肤浸润增厚明显,并于第14天皮肤肥厚达到高峰,尤以实验4组最明显,这与改良型银屑病造模模型表现相符。相比较而言,对照1、对照2及对照3三组皮损的严重程度及皮疹变化时间相差不显,说明腹腔注射他莫昔芬对银屑病样小鼠皮损无干预作用;实验4的皮损严重程度整体重于对照1、对照2及对照3三组皮损情况,说明Spred-1敲低在一定程度上能加重小鼠银屑病样皮损;这可能与他莫昔芬注射可诱导Spred-1基因敲低小鼠使Spred-1基因下调有关。此外,实验4组小鼠PASI评分在实验过程中大体高于对照1、对照2及对照3三组,差异有统计学意义（P＜0.05）,皮肤病理Baker评分也高于对照1、对照2及对照3三组,有统计学意义（P＜0.05）,说明Spred-1基因敲低能加重银屑病样小鼠皮损及皮损病理的严重程度;这可能与他莫昔芬注射可诱导Spred-1基因敲低小鼠使Spred-1基因下调有关。而对照1、对照2及对照3三组小鼠相比,PASI评分无统计学意义（P＞0.05）,皮肤病理Baker评分也无统计学意义（P＞0.05）,说明他莫昔芬注射后对改良型诱导的银屑病样小鼠皮损及皮损病理无影响。5.在Spred-1基因敲低实验中,Spred-1基因诱导敲低后实验4组ERK 1m RNA、ERK 2 m RNA、Ras m RNA、Raf1 m RNA、VEGF m RNA表达及p-ERK、p-Ras、Ras、VEGF的蛋白表达较对照1、对照2及对照3组相比显著升高（P＜0.001）,ERK、p-Raf1蛋白表达（P＜0.01）及Raf1蛋白表达（P＜0.05）相比也升高,有统计学差异,说明Spred-1基因敲低后不能抑制Ras/ERK通路相关蛋白及m RNA表达,加重了银屑病样小鼠症状;而对照1、对照2及对照3组相比,三组通路上的ERK1、ERK 2、Ras、Raf 1、VEGF m RNA表达及p-ERK、ERK、p-Ras、Ras、p-Raf1、Raf1、VEGF蛋白表达无统计学意义（P＞0.05）,说明他莫昔芬对Ras/ERK通路上的相关蛋白及m RNA表达无影响,在本次实验中,主要应用进行Spred-1基因的诱导性敲低,对疾病本身无影响。6.在中药干预实验中,在实验前1天对照5组小鼠体内Spred-1 m RNA表达正常,与实验6组、对照7组及模型8组相比,无显著差异（P＞0.05）,说明Spred-1基因在四组小鼠中均可正常表达Spred-1 m RNA。在实验第10天对照5组小鼠体内Spred-1 m RNA表达正常,实验6组、对照7组及模型8组小鼠体内Spred-1 m RNA表达明显降低,二者相比有统计学差异（P＜0.001）,说明他莫昔芬未敲低对照5组小鼠中的Spred-1基因,敲低了实验6、对照7及模型8组中的Spred-1基因。同时,在实验第24天,与对照5组相比,实验6组、对照7组及模型8组的Spred-1 m RNA表达明显降低,有显著差异（P＜0.001）,说明在小鼠灌胃给药过程中,对照5组小鼠处于Spred-1基因正常表达状态,实验6组、对照7组及模型8组小鼠处于Spred-1基因被敲低状态;而与实验6组相比,对照7组的Spred-1 m RNA表达较低（P＜0.05）,模型8组的Spred-1 m RNA表达相比也较低（P＜0.01）,均有统计学意义,说明清血毒颗粒合剂在灌胃给药后上调了Spred-1的m RNA表达;此外,对照7组与模型8组相比,无统计学意义（P＞0.05）,说明复方青黛胶囊对Spred-1的m RNA表达无明显影响。7.在中药干预实验中,四组小鼠均从造模第2、3天开始逐渐出现淡红斑、细薄鳞屑,于第4、5天出现明显红色斑、鳞屑成层,模型8组随着时间推移,斑片颜色逐渐加深,出现深红色斑片,鳞屑堆积成层,皮肤浸润肥厚,说明应用改良型诱导的银屑病样小鼠造模成功。相比而言,对照5组、实验6组、对照7组的红斑、浸润肥厚、鳞屑症状明显轻于模型8组,说明清血毒颗粒合剂和复方青黛胶囊对改良型诱导的银屑病样小鼠均具有治疗作用。此外,对照5组与实验6组相比,我们发现对照5组小鼠的症状消退速度明显较实验6组快,说明清血毒颗粒合剂通过上调Spred-1蛋白的表达干预了银屑病的治疗。同时,实验6组与对照7组相比,实验6组的红斑、浸润、鳞屑消退速度与对照7组相差不显,说明Spred-1基因被敲低后,清血毒颗粒合剂和复方青黛胶囊均不能干预Spred-1蛋白靶点抑制银屑病的发生。8.在小鼠灌胃给药治疗后,对照5组、实验6组、对照7组三组的PASI评分及皮肤组织病理Baker评分均低于模型8组小鼠（P＜0.05）,说明清血毒颗粒合剂和复方青黛胶囊两种药物对改良型诱导的银屑病样小鼠皮损及皮损组织病理严重程度均具有明显的改善作用。同时,对照5组小鼠PASI评分及Baker评分明显低于实验6组、对照7组（P＜0.05）,说明清血毒颗粒合剂在未被敲低Spred-1基因的小鼠中,明显上调了Spred-1蛋白,继而减轻了银屑病样小鼠的皮损症状及组织病理严重程度。而实验6组与对照7组组相比,实验6组的红斑、浸润、鳞屑的消退速度及皮损组织病理Baker评分与对照7组相差不显,无统计学差异（P＞0.05）,说明Spred-1基因被敲低后,清血毒颗粒合剂不能明显上调Spred-1蛋白来干预银屑病的治疗,进一步证明Spred-1蛋白是清血毒颗粒合剂治疗银屑病的作用靶点。9.在中药干预实验中,与对照5、实验6、对照7组相比,模型8组小鼠ERK1、ERK2、Ras的m RNA表达及ERK、p-Ras、Ras、Raf1、VEGF的蛋白表达较高,有统计学差异（P＜0.001）,Raf1、VEGF的m RNA表达及p-ERK、p-Raf1的蛋白表达相比也较高（P＜0.01）,说明清血毒颗粒合剂和复方青黛胶囊灌胃给药后,显著下调了Ras/ERK通路上的相关蛋白及m RNA表达,继而干预银屑病的治疗。而对照5组与实验6组、对照7组相比,银屑病样小鼠中的Ras、Raf1（P＜0.001）,ERK2（P＜0.01）,ERK1、VEGF（P＜0.05）的m RNA表达及Ras、VEGF（P＜0.001）,p-Ras、Raf1（P＜0.01）,p-ERK、ERK、p-Raf1（P＜0.05）的蛋白表达下降更为明显,表明Spred-1基因被敲低后,不能抑制Ras/ERK通路上的相关m RNA及蛋白表达来治疗银屑病。此外,实验6组与对照7组相比,无统计学意义（P＞0.05）,进一步说明Spred-1基因被敲低后,清血毒颗粒合剂和复方青黛胶囊对抑制Ras/ERK通路上的相关m RNA及蛋白表达差异不显。结论:1.通过应用Cre-lox P系统构建了Spred-1基因敲低小鼠,应用自然繁殖的方法最终获得24只非可诱导Spred-1基因敲低小鼠和40只可诱导Spred-1基因敲低小鼠。2.通过评价银屑病小鼠模型的构建方法,发现应用改良型造模方法明显有效,说明通过改良型方法进行银屑病小鼠模型造模可实现银屑病14日造模效果。3.在银屑病样小鼠皮肤组织中,Spred-1基因被敲低后,Ras/ERK通路相关蛋白及m RNA表达均升高;说明Spred-1基因被敲低后不能抑制Ras/ERK通路相关蛋白及m RNA表达,加重了小鼠的银屑病病情。4.Spred-1基因被敲低后,清血毒颗粒合剂和复方青黛胶囊的疗效相差不显;而清血毒颗粒合剂治疗Spred-1基因未被敲低及被敲低后的银屑病样小鼠,二者疗效相差明显;充分说明清血毒颗粒合剂是通过干预Spred-1蛋白调控Ras/ERK通路上相关蛋白及m RNA水平的表达而达到治疗银屑病的作用。