【摘 要】
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目的:原核表达VP3与Tat-PTD（protein transduction domain）的融合蛋白,并纯化此融合蛋白,观察Tat-PTD介导VP3进入胃癌细胞SGC7901的透膜效应及VP3在肿瘤细胞中的定位,检测融合蛋白诱导细胞凋亡情况。方法:（1）构建含有凋亡素基因VP3和Tat-PTD结构域的原核重组质粒pET32α（+）-Tat-PTD-VP3;（2）将重组质粒转染E.coli BL
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目的:原核表达VP3与Tat-PTD（protein transduction domain）的融合蛋白,并纯化此融合蛋白,观察Tat-PTD介导VP3进入胃癌细胞SGC7901的透膜效应及VP3在肿瘤细胞中的定位,检测融合蛋白诱导细胞凋亡情况。方法:（1）构建含有凋亡素基因VP3和Tat-PTD结构域的原核重组质粒pET32α（+）-Tat-PTD-VP3;（2）将重组质粒转染E.coli BL21细菌,通过ITPG诱导表达融合蛋白Tat-PTD-VP3,并检测其免疫原性;（3）采用ITPG大量诱导表达Tat-PTD-VP3融合蛋白,并将此融合蛋白经50%Ni+-NTA柱纯化,PBS过夜透析;（4）将纯化后融合蛋白与常规培养的人胃癌细胞株SGC7901及脐静脉内皮细胞共培养,荧光显微镜观察蛋白进入细胞情况,并采用TUNEL试剂盒检测细胞凋亡状况。结果:（1）成功构建了VP3和Tat-PTD的重组载体,并以增强绿色荧光蛋白作为报告基因,酶切后片段约为1100bp,与设计的目的基因片段大小相一致;（2）诱导表达含重组质粒的E.coli BL21细菌,得到分子量为42kD大小的融合蛋白,大约占菌体蛋白总量的20%;（3）凝胶灰度扫描证实,经50% Ni+-NTA纯化后得到纯度大约为90%的融合蛋白;（4）荧光显微镜证实融合蛋白在30 min之内即可稳定转入细胞,且定位于肿瘤细胞核中;（5）TUNEL试剂盒定性检测细胞凋亡,证实VP3蛋白能明显促进肿瘤细胞的凋亡。结论:纯化后的Tat-PTD-VP3融合蛋白具有高效透膜效应,并能特异性诱导SGC7901细胞凋亡,为应用VP3蛋白治疗胃癌的实验研究奠定了基础。
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目的:构建携带人FBP17基因真核重组质粒p3×FLAG-CMV-10/FBP17,并转染人正常肝细胞LO2,验证已转染重组质粒p3×FLAG-CMV-10/FBP17的LO2高表达FBP17,为FBP17相互作用蛋白研究打下坚实的基础。方法:（ 1 ）构建重组质粒p3×FLAG-CMV-10/FBP17。通过酶切pEGFP-C1-FBP17质粒,产物纯化后与p3×FLAG-CMV-10载体进行连
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