线粒体移植可以改善卵母细胞衰老引发的生殖力下降和不孕。然而,异体线粒体移植会导致异质性风险和“三亲”婴儿伦理问题,因此极大地限制了该技术的临床应用。基于此原因,线粒体转移技术的研究重点转向自体方法的研发。但目前自体线粒体替代方法的策略远非最佳,原因主要有两点:i)线粒体供体细胞的采集涉及侵入性手术,会给母体带来损害和痛苦;ii)线粒体转移策略涉及显微注射、电融合或人工激活等手段,这些操作会导致卵母细胞的机械损伤、非整倍体和细胞内信号转导失调。因此,自体线粒体移植策略的线粒体供体来源和操作程序步骤需要进一步优化。本论文拟解决的主要科学问题是进一步优化当前用于衰老卵母细胞再生的线粒体转移技术,以最大限度地减轻患者的痛苦和移植操作对卵母细胞的损伤。本研究取雌性小鼠胎儿的脐带,分离脐带间充质干细胞（UC-MSCs）并冷冻保存。对应的雌性衰老后（10～12月龄）,采集其生发泡期（GV）卵母细胞并进行透明带弱化处理。将雌性自体UC-MSCs诱导成颗粒细胞（iGCs）。将透明带弱化的GV卵母细胞与自体iGC聚合构建iGC-卵母细胞复合体。然后,将构建好的复合体在含有GDF9的培养液中培养3天。接下来,对iGC-卵母细胞复合体进行体外成熟和体外受精操作。将受精卵培养24小时后,选择分裂的2-细胞胚胎进行胚胎移植。结果显示弱化透明带有利于形成更宽的跨透明带丝状伪足,从而显著地促进了iGCs与卵母细胞之间的线粒体转运。基于该发现,构建iGC-卵母细胞复合体并在含GDF9的培养液中孵育,结果显示线粒体可以沿iGCs产生的跨透明带丝状伪足迁移到衰老的GV卵母细胞中。与对照卵母细胞相比,处理组的卵母细胞显示出较低的异常线粒体比例（19.1±1.9%vs.60.1±3.5%;P＜0.0001）,更高的ATP含量（816.1±13.3 fmol/卵母细胞vs.393.6±10.1 fmol/卵母细胞;P＜0.0001）,以及降低细胞内ROS水平（P＜0.0001）。体外成熟实验中,处理组的GV卵母细胞成熟率得到了显著提高（92.9±4.1%vs.68.4±3.4%;P＜0.05）;并且,线粒体转运明显改善了成熟卵母细胞中的纺锤体异常情况（10.9±2.9%vs.54.2±2.2%）;P＜0.001)。体外受精后,可以观察到处理组的2-细胞胚胎发育率明显升高（86.2±1.9%vs.50.3±1.3%;P＜0.0001）。而且,与对照组相比,将2-细胞胚胎进行胚胎移植后,处理组的幼崽出生率也得以改善（26.1±1.5%vs.2.7±1.7%;P＜0.0001）。这些结果表明,本论文所建立的无创自体线粒体转运策略使衰老卵母细胞的质量、成熟率和发育潜能显著提高。综上,将自体脐带间充质干细胞诱导的颗粒细胞（iGCs）与透明带弱化的生发泡期卵母细胞聚合（aggregation）构建iGC-卵母细胞复合体,以GDF9诱导iGCs与卵母细胞之间形成跨透明带丝状伪足（transzonal filopodia）,线粒体可以通过跨透明带丝状伪足转运进入卵母细胞,使衰老的卵母细胞恢复活力,改善衰老引发的生殖力下降和不孕。本研究为线粒体通过颗粒细胞与卵母细胞间的跨透明带丝状伪足迁移提供了直接证据,并明确透明带弱化是该转移发生的必要条件。基于这一发现,本研究建立了一种无创卵母细胞再生策略,该策略最大限度地降低了传统自体线粒体移植方法对母体和卵母细胞的潜在损伤。这一无创自体方法为解决人类辅助生殖领域中卵子衰老导致的女性生殖力下降和不孕的问题,为当前大龄女性卵母细胞衰老的治疗需求提供了新的参考。本研究设计优化的无创自体线粒体转运策略以UC-MSCs作为线粒体供体细胞,其采集不需要侵入性手术,因此避免了对母体的伤害;通过构建iGC-卵母细胞复合体,使iGCs中年轻健康的线粒体经跨透明带丝状伪足转运到衰老卵母细胞中,从而改善了卵母细胞衰老导致的不孕,这种新策略不涉及显微注射、电融合和人工激活,因此它对卵母细胞也是“无创”的,有益于后代的健康。