背景:新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种临床上非常常见的机会致病菌,在世界范围内具有聚集性发病、广泛性分布的特征。免疫系统功能低下的人群是隐球菌病的易感人群,如AIDS患者及器官移植患者,但近年来,越来越多的非免疫缺陷感染者的出现使得隐球菌感染受到越来越多的关注。新型隐球菌作为一种酵母—菌丝双态性真菌,其形态转化深刻地影响和塑造了隐球菌的毒力。酵母形态是隐球菌高毒力形态,也是隐球菌的主要感染和致病性形态,而处于菌丝体状态的隐球菌则会完全丧失毒性。不仅如此,隐球菌的形态转换也通常和有性生殖密切相关,而有性生殖过程中通过遗传重组和减数分裂产生的有性孢子的遗传多样性是临床上高毒力菌株涌现的一个重要因素。因此,对新型隐球菌形态发育及有性生殖机制的深入研究有助于我们寻找新的治疗隐球菌病治疗策略和揭示隐球菌毒力演化机制。本研究在课题组前期基础上鉴定出了一个新基因—REI1,并对REI1的功能进行了分析和研究。方法:本研究在鉴定REI1基因的基础上,对其序列和结构域进行分析,以新型隐球菌实验室菌株XL280 alpha和a为背景菌株,采用CRSPR-Cas9联合电穿孔技术构建REI1缺失突变株,再将含REI1自身启动子及目的基因的质粒随机插入缺失株基因组构建回补菌株,以XL280野生型和REI1回补菌株为对照深入分析和探究REI1在新型隐球菌中的遗传学功能,主要包括以下几个方面:生长发育、毒力因子、环境胁迫以及有性生殖。结果:1、REI1基因的鉴定与分析从前期RNASeq结果中鉴定到一个功能未知的基因REI1,该基因核苷酸序列长度为1778bp,含有3个内含子,编码413个氨基酸;对Rei1蛋白结构域分析发现其主要包含2个锌指结构域。系统进化树分析发现,Rei1蛋白在真菌中具有较高的保守性。通过q RT-PCR方法分析了REI1在新型隐球菌有性生殖早期以及各发育时期的表达情况,结果发现REI1在新型隐球菌交配早期的表达呈先升高后下降的趋势,且该趋势与ZNF2、PUM1等趋势相似,由此推测REI1可能在新型隐球菌有性生殖过程中发挥了重要作用。2、REI1基因敲除和互补菌株的构建为了进一步研究REI1的功能,我们采用CRSPR-Cas9联合电穿孔技术在XL280 alpha和a背景下构建了REI1基因敲除突变体rei1Δ;通过构建含REI1自身启动子及目的基因的质粒,经电穿孔技术将质粒随机插入rei1Δ突变体基因组内,从而获得REI1互补菌株。3、REI1基因敲除和回补株表型分析1)通过观察菌株在培养基上的生长情况及生长曲线测定发现,rei1Δ突变体生长受到一定影响;温度敏感性实验发现,缺失株在低温条件下表现出明显的生长缺陷,尤其是4℃条件下,缺失突变体几乎不生长。2)在Na Cl、Sorbitol、Congo red、SDS等压力应激以及不同碳源培养条件下,缺失突变株与野生型菌株相比生长无明显变化。3)经典毒力因子检测发现,rei1Δ突变体在DMEM培养基上诱导形成的荚膜直径较野生型相比明显减小,且在37℃条件下生长稍弱。4)菌丝形成及产孢实验发现,无论是同性生殖还是异性生殖,与野生型相比,rei1Δ突变体的菌丝形成均受到明显的抑制,几乎无菌丝生长,亦无担子及孢子的产生。5)荧光定量PCR数据显示,在菌丝诱导条件下,REI1缺失后信息素途径上多个重要基因如MAT2、ZNF2等表达量达到峰值的时间均晚于野生型,且MAT2表达增加,而ZNF2和CFL1表达明显下降。结论:本研究鉴定了一个新的与新型隐球菌生长及菌丝形成相关的基因REI1,并通过基因的具体功能探索发现REI1参与了新型隐球菌生长和有性生殖的调控,并可能因此而改变菌株的毒力,减弱其致病性。REI1基因功能的分析为阐明新型隐球菌有性生殖和致病机制提供了新的思路。