【摘 要】
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微生物脂肪酶盖子（Lid）结构域覆盖在脂肪酶活性中心的上方;具有无盖、单盖和双盖等多种结构形式;在油-水界面,盖子结构通过其构象的变化,控制活性中心的开放与关闭,致使脂肪酶表现出独特的“界面激活（Interfacial activation）”的催化特性。除了与界面激活的催化特性密切相关外,盖子结构还影响到脂肪酶对底物的选择性、脂肪酶的热稳定性等多种特性。伯克霍尔德菌（Burkholderia s
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微生物脂肪酶盖子（Lid）结构域覆盖在脂肪酶活性中心的上方;具有无盖、单盖和双盖等多种结构形式;在油-水界面,盖子结构通过其构象的变化,控制活性中心的开放与关闭,致使脂肪酶表现出独特的“界面激活（Interfacial activation）”的催化特性。除了与界面激活的催化特性密切相关外,盖子结构还影响到脂肪酶对底物的选择性、脂肪酶的热稳定性等多种特性。伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）脂肪酶LipA属于“双盖”脂肪酶,双盖脂肪酶的两个盖子结构域如何实现互作,到目前为止仅有零星的报导,且均来自于生物信息学分析的结果。本研究拟通过向两个盖子结构域之间引入二硫键,考察两个盖子结构域之间的互作及其对酶学性质的影响。此外,还表征了盖子结构域突变对酶热稳定性的影响。具体研究结果如下:1、利用生物信息学软件预测Burkholderia sp.脂肪酶LipA盖子结构域内可形成二硫键的位置。利用软件Disulfide by Design2.0、MODIP、SSBOND和Bridge D预测脂肪酶LipA盖子结构域范围内可形成二硫键的突变位置,结合脂肪酶LipA的3D结构,最终筛选出由8个脂肪酶LipA突变体组成的Mini突变体电子文库,包括LipA-E118C/R258C、LipA-E118C/S260C、LipA-A120C/L167C、LipA-D130C/S135C、LipA-V143C/A160C、LipA-G147C/Q158C、LipA-M255C/S260C和LipA-S260C/S268C。生物信息学预测:上述脂肪酶LipA突变体的盖子结构域,均引入了新的二硫键。2、LipA盖子结构域新形成的二硫键对其酶学性质影响的实验分析。利用定点突变技术构建上述突变体电子文库中的8个突变体基因;经诱导表达并纯化后,Ellman法检测确定,突变体LipA-E118C/R258C、LipA-E118C/S260C、LipA-D130C/S135C、LipA-G147C/Q158C、LipA-M255C/S260C和LipA-S260C/S268C的盖子结构域正确引入了二硫键。继而分别了测定了上述6个突变体的动力学常数、热稳定性,并分析了不同浓度pNPB对各突变体水解活性的影响。实验结果表明:形成二硫键的六个突变体中,仅LipA-G147C/Q158C的T5012值较野生型提高了3.60℃;55℃下的半衰期延长至野生型的1.69倍且kcat/Km为野生型的1.17倍,其余突变体的热稳定性及kcat/Km保持不变或不同程度受损。当pNPB为2 mmol/L至3 mmol/L浓度范围时,6个突变体的相对水解活性相继达到最大,是pNPB浓度为0.20 mmol/L时水解活性的269.55%至370.37%不等。此外,对突变体LipA-E118C/S260C进行的分子动力学模拟结果表明:在二硫键的作用下突变体LipA-E118C/S260C盖子结构域中α9螺旋的RMSD值较野生型大幅下降。3、脂肪酶LipA盖子结构域定点突变对脂肪酶酶学性质影响的表征及热稳定性分析。课题组前期针对具有高度柔性的盖子结构域构建了系列突变体,包括:LipA-E35P/N125D、LipA-E35P/N125E、LipA-E35P/Q262E和LipA-F221D/N125E,以期考察盖子结构域突变对脂肪酶热稳定性的影响。由于时间关系,未能完成纯化及酶学性质表征工作。本研究对上述突变体进行了纯化,测定其基本酶学性质,并与野生型脂肪酶LipA作比较。实验结果表明:突变体LipA-E35P/N125D、LipA-E35P/N125E、LipA-E35P/Q262E和LipA-F221D/N125E的kcat/Km分别为3.80×105L/mmol·min、3.61×105L/mmol·min、3.13×105L/mmol·min、2.69×105L/mmol·min;T5012值分别较野生型脂肪酶提高了7℃、9.30℃、7.60℃和7.80℃;55℃下的半衰期分别延长至野生型的21.13倍、38.14倍、14.74倍和18.56倍。
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