龙眼（Dimoarpuslongan Lour.）为无患子科（Sapindaceae）龙眼属（Dimocarpus）植物,是我国热带亚热带名贵特产果树。龙眼具有很高的食用和药用价值,其功能性代谢产物主要包括多糖、类黄酮、生物碱、类胡萝卜素等。而光调控被看作改变植物细胞功能性代谢产物合成的重要方法之一。为进一步挖掘龙眼功能性代谢产物有益基因资源,本研究以龙眼胚性愈伤组织（龙眼EC）为材料,进行不同光质处理下的转录组学分析。在不同光质处理下龙眼EC功能性代谢产物和生理生化测定分析的基础上,利用高通量测序技术,进行龙眼EC响应不同光质的mRNAs、miRNAs转录组学分析,以及部分mRNAs、miRNAs与靶基因的qPCR验证。克隆了光响应基因（BRI1家族）和miRNAs前体,并进行光响应的表达验证以及部分miRNAs的功能研究。基于转录组的研究基础,探索生物反应器中蓝光对龙眼细胞培养及功能性代谢产物的影响。本研究诣在探讨光调控龙眼功能性代谢产物的机制,为挖掘利用龙眼功能性代谢产物的光响应基因资源提供科学依据。主要研究结果如下:1.不同光质对龙眼EC的功能性代谢产物积累及生理生化指标的影响以龙眼EC为研究对象,采用L9（34）正交试验设计方法设置胚性愈伤组织生长光环境条件（光质、光强、光周期、天数）,优化其功能代谢产物合成的光照模式。结果表明龙眼EC功能代谢产物合成的最佳光照模式为:蓝光,32 umol·m-2·S-2,12h/d,25d。基于正交试验所得的最佳光照模式,选取黑暗、蓝光和白光对龙眼EC进行处理。比较龙眼EC在不同处理下增殖率、功能性代谢产物和生理生化变化,结果表明蓝光培养下的胚性愈伤组织增殖率高于暗培养,而白光的胚性愈伤组织增殖率则低于暗培养;光照对龙眼EC中多糖、生物素、生物碱、类黄酮均起到促进作用,而蓝光对这4种功能性代谢产物促进作用优于其它处理;蓝光处理的SOD、POD、PAL酶活性和H2O2含量最高,白光处理次之,黑暗处理最低,表明光照激活了龙眼EC酶类抗氧化系统。2.不同光质对龙眼EC功能性代谢产物积累的转录组学分析采用高通量测序方法,对不同处理（黑暗,蓝光,白光）的龙眼EC进行mRNAs测序,并对测序结果进行分析验证。在DB（Dark VS Blue）和DW（Dark VS White）组合中,鉴定出差异表达基因数量分别为4463个和1639个,其中上调表达基因数量分别为3096个和759个,下调表达基因数量分别为1367个和880个。转录组差异表达基因的GO和KEGG富集分析结果表明跨膜转运、磷酸化、钙离子转运、赖氨酸生物合成、生物素代谢、次生代谢等一些基础途径在光响应过程中高度富集。差异表达基因的初级代谢的Mapman分析发现多数差异基因主要分布于细胞壁、脂类、蔗糖、淀粉、氨基酸途径。次生代谢的Mapman分析发现多数差异基因主要分布于莽草酸途径、苯丙烷类化合物、单酚、木质素和木脂素类、类黄酮途径。DB组合中每个途径的差异表达基因数目均多于DW组合,表明蓝光对龙眼EC代谢途径和其它过程的影响更为显著。差异表达基因的转录因子分析发现PIF4、ARF、MYC2等均为龙眼受光照影响显著的转录因子。基于前人的研究和转录组数据挖掘,初步构建了影响龙眼功能性代谢产物的蓝光信号网络。qPCR验证结果表明蓝光信号网络基因的相对表达量符合mRNAs测序结果。3.不同光质对龙眼EC功能性代谢产物积累的miRNAs分析采用高通量测序方法,对不同处理（黑暗,蓝光,白光）的龙眼EC进行miRNAs测序,并对测序结果进行分析验证。共获得30个miRNA家族的111个已知miRNAs,DB和DW组合特异表达已知miRNAs分别为24和16个;获得103个Novel miRNAs,DB和DW组合特异表达Novel miRNAs分别为5和6个。miRNA靶基因的KEGG富集分析结果表明光对龙眼功能性代谢产物合成存在多种光响应途径,包括植物激素信号转导、植物MAPK信号转导等。miRNA 靶基因的 Cytoscape 分析结果表明 miR171d1、miR394a、miR396b-5p、miR5139最有可能参与蓝光对龙眼EC的影响;miR171d1、miR319e、miR394a、miR395b2、miR396e最有可能参与白光对龙眼EC的影响。miRNAs靶基因的Mapman结合表达量的热图分析表明蓝光对细胞信号传导、多糖代谢、生物素合成、类黄酮代谢的调控作用显著高于其它处理。基于前人的研究和miRNAs组学数据挖掘,本研究发现miR171f3靶定DELLA、miR390e靶定BRI1、miR396b-5p靶定EBF1/2、EIN3可能参与到蓝光信号网络,进而调控龙眼功能代谢产物积累。qPCR验证结果表明龙眼miRNAs与其靶基因之间存在复杂的调控关系,既有正调控、也有负调控。在不同光质响应过程中,一些miRNAs能够负调控其靶基因,一些miRNAs只在特定的光质下负调控其靶基因。4.龙眼光响应miRNAs的前体克隆及分子特性与表达分析在龙眼EC miRNAs组学结果分析的基础之上,挑选光对龙眼EC功能性代谢产物调控中起到关键作用且差异表达的miR396a-3p、miR396b-5p进行深入分析验证。首先,利用miRbase（21.0）数据库下载已登录的miR396的前体和成熟体序列,采用生物信息学分析方法,对植物miR396a和miR396b的进化与分子特性进行分析。结果表明物种特异性是影响植物miR396前体进化的重要因素,而序列保守性是影响成熟体进化的主要因素。由5P臂上形成的miR396成熟体序列保守性较高,由3P臂上形成的miR396成熟体序列特异性较大;茎序列的保守性高于环序列,5p臂上保守性高于3p臂。其次,在对植物miR396a和miR396b进化与分子特性分析的基础上,参考龙眼miRNAs组学测序结果,采用PCR克隆方法,从中获得miR396a-3p和miR396b-5p前体序列,长度都为300 bp。同时,对龙眼miR396a-3p和miR396b-5p的启动子进行分析,结果表明两者均含有较多的光响应元件、激素响应元件及其生物和非生物胁迫响应元件。而个别元件在miR396a-3p和miR396b-5p中具有特异性。miR396a-3p启动子含有4个生物钟作用元件;miR396b-5p含有9个茉莉酸甲酯响应元件。启动子顺式元件分析结果说明miR396a-3p和miR396b-5p可能通过这些顺式元件在龙眼光响应过程中起调控作用。最后,对龙眼miR396a-3p和miR396b-5p在不同组织部位（根、茎、新叶、雄花、雌花、幼果、果肉、果核）的表达量进行qPCR分析,结果表明miR396a-3p2、miR396b-5p在不同组织部位都呈现相似的表达模式;miR396a-3p2、miR396b-5p均在根中的表达量最高,而在新叶和幼果的表达量最低。对不同光质的表达量进行qPCR验证,结果表明miR396a-3p2、miR396b-5p均为miR396家族成员,但是其表达模式却截然不同。对龙眼miR396和靶基因在不同光强的蓝光（黑暗、16、32、64、128 umol·m-2·S-2）的表达模式进行qPCR分析,结果表明miR396b-5p与其靶基因（EBF1/2、EIN3、GRF2、、RD21aFLS2）的表达趋势基本呈现负相关,miR396b-5p可能通过负调控其靶基因参与蓝光对龙眼EC的生长发育或功能性代谢产物的影响。而靶基因rpoA可能由miR396a-3p2与其它miRNAs或家族成员同时调控,从而实现靶基因转录水平的调控。5.龙眼BRI1基因家族的全基因组鉴定与表达分析及相关功能研究在不同光质对龙眼EC的miRNAs组学分析结果可知,差异表达miR390e的一个靶基因为BRI1,mRNAs组学结果中BRI1也是差异表达基因,并且它们均为蓝光调控龙眼功能代谢产物的关键基因。因此,本研究对龙眼BRI1基因家族进行进一步的成员鉴定以及光响应表达分析研究,同时还对龙眼miR390e进行靶标验证与功能研究。采用RT-PCR结合RACE技术,参考龙眼基因组序列,从龙眼EC中获得4条BRI1基因家族全部成员完整的CDS序列。为了解龙眼BRI1基因家族的生物学功能,采用生物信息学法进行以下分析。亚细胞定位预测表明DlBRIl-1,DlBRI1-2a和DlBRI1-3均定位于细胞质膜,而DlBRI1-2b定位于细胞核。磷酸化位点预测表明DlBRI1属于丝氨酸/苏氨酸激酶。基因结构分析表明DlBRI1是一种无内含子基因,无内含子基因在转录的过程中不需要经历内含子的剪切步骤,是响应外界因素的一种快速应答基因。蛋白保守结构域分析表明龙眼BRI1蛋白家族为植物富亮氨酸重复类受体蛋白激酶的一种,其在植物激素信号转导和非生物胁迫中具有重要调控作用。系统进化树分析表明DlBRI1-2a和DlBRI1-2b同源性较高。启动子顺式元件预测发现龙眼BRI1四个家族成员启动子均含有大量的光响应元件、激素应答元件、非生物胁迫响应元件,表明龙眼BRI1家族基因可能是连接光信号转导与激素信号转导的重要纽带。互作的miRNA预测表明DlBRI1-3分别受到miR390a-5p和miR390e的调控。采用荧光定量PCR技术检测龙眼BRI1家族成员在不同体胚发生过程和不同组织部位的表达情况,结果表明DlBRI1-1和DlBRI1-3在体胚发生过程和不同组织部位中均呈现高表达,推测DlBRI1-1和DlBRI1-3可能在龙眼整个生长发育过程中起到更为关键的作用。对不同光质处理下的龙眼EC的miR390e、BRI1基因家族成员及其上下游基因进行实时荧光定量分析,推测蓝光信号刺激蓝光受体,改变它们的构象并且激活了 BR信号通路。蓝光信号使得miR390的表达量显著减少,导致靶基因BRI1-3的表达量增加,从而影响油菜素内脂从属基因BZR1、转录因子PIF4,进而影响龙眼功能性代谢产物积累。通过RLM-RACE法进行靶基因裂解位点验证,结果表明miR390e能够剪切DlBRI1-3从而抑制其mRNA转录。基于龙眼EC上建立的miRNA高效过表达和抑制表达体系,通过过表达和抑制表达miR390e,验证miR390e与DlBRI1-3的调控关系,龙眼BRI1其它家族成员和下游途径基因的影响,并测定agomir390e、antagomir390e、CK的功能性代谢产物含量。结果表明miR390e与靶基因DlBRI1-3的表达趋势成负相关,miR390e能够负调控靶基因DlBRI1-3。当agomiR390e使miR390e过表达时,DlBRI1-3的表达量低于对照组,总黄酮和生物碱含量下降;当antagomiR390e使miR390e抑制表达时,DlBRI1-3的表达量高于对照组,总黄酮和生物碱含量提升。综上,miR390e可以通过负调控靶基因DlBRl1-3影响龙眼功能性代谢产物合成。6.生物反应器中蓝光对龙眼细胞培养及功能性代谢产物的影响相比于植物组织培养和摇瓶培养,植物生物反应器是大量获取功能性代谢产物的有效工具。本研究将前文的结论应用于生物反应器中龙眼细胞培养,获取黑暗和蓝光培养过程的变化规律,并验证转录组的部分结论。基于摇瓶培养中所建立的龙眼胚性悬浮细胞体系,对生物反应器中通气量和搅拌速度两个重要参数进行优化,初步建立生物反应器中龙眼胚性悬浮细胞培养体系。结果表明生物反应器的最佳通气量为100 ccm,最佳搅拌速度为100 rpm。在转录组分析的基础上,本研究进一步探讨生物反应器中蓝光对龙眼细胞生长及功能性代谢产物的影响。基于已建立并优化的龙眼胚性悬浮细胞培养体系,研究悬浮细胞在黑暗和蓝光的培养过程中细胞生长量,总黄酮含量,生物碱含量,细胞活力,培养液的底物消耗量（蔗糖、还原糖、磷酸盐）,培养体系的pH及溶氧的变化情况等。结果发现:培养9 d后,龙眼胚性悬浮细胞放大约3倍,蓝光处理的细胞干重比黑暗处理增长了 0.28 g/l,总黄酮含量增长了 0.77 mg/g,生物碱含量增长了 1.93 mg/g。培养液中蓝光处理的总黄酮含量对比黑暗处理无明显差异,但生物碱含量却增长了 0.75 mg/ml。细胞培养前期蓝光的培养液蔗糖消耗速度慢于黑暗培养,此后蔗糖含量均稳定在2 g/1之间。培养过程中,蓝光培养的还原糖的含量低于黑暗培养,蓝光的磷酸盐的消耗量基本大于黑暗培养。通过qPCR技术对光信号因子（DlHY5、DlPAP1、DlMYC2和DlPIF4）和代谢途径合成基因（DlCHS）等进行表达量差异分析,验证生物反应器中蓝光对龙眼胚性悬浮细胞次生代谢合成的作用机制。结果表明蓝光可能通过光信号转录因子DlHY5调控DlPAP1的表达,从而调控类黄酮代谢途径合成基因DlCHS的表达,进而影响龙眼胚性悬浮细胞的总黄酮含量积累。蓝光还可能通过转录因子DlMYC2和DlPIF4调控总黄酮、生物碱的合成。