论文部分内容阅读
第一部分构建经TGF-β1诱导的EMT化的膀胱尿路上皮细胞癌T24细胞并验证目的探索利用TGF-β1因子提高人膀胱尿路上皮癌T24细胞系EMT水平的最佳诱导浓度和诱导时间,并进行基因表达、生物学行为等的验证。方法培养人膀胱尿路上皮癌T24细胞系并传代,使用不同浓度的TGF-β1因子进行诱导,然后在不同时间点对细胞形态变化进行观察。利用实时荧光定量PCR技术对上皮细胞-间质转化的标志物(如：Vimentin、MMP2、E-cadherin、slug、ZEB1等等)的表达水平进行检测。利用细胞划痕试验、Transwell小室迁移试验等对诱导前后细胞的侵袭、穿透、迁移等能力进行检测和评估,进一步验证TGF-β1因子在T24细胞EMT进程中的最佳诱导浓度和诱导时间。结果浓度为lOng/ml的TGF-β1诱导T24细胞36h后,T24细胞的细胞形态变化提示有上皮细胞间质化发生；同时,EMT标志基因的表达水平亦出现相应改变,如：间质细胞标志物Vimentin和MMP2表达水平上调,E-cadherin等上皮细胞标志物表达下调,slug、 ZEB1等促EMT因子表达上调；另外,细胞划痕试验显示,lOng/ml的TGF-β1因子诱导前后两组的平均愈合面积(百分比)差异有显著性(0.81vs1,P<0.05)；同样,Transwell小室迁移试验检测T24-N.C.组和T24-TGF-β1组细胞的侵袭情况发现10ng/mlT24-TGF-β1组细胞侵袭能力明显增强,(每视野平均细胞数54.6vs97.65,P<0.05)。结论膀胱尿路上皮癌T24细胞经浓度为10ng/ml的TGF-β1因子诱导36小时后其细胞形态学呈现较为明显的上皮细胞间质化改变。并且其诱导后细胞的基因呈现EMT化的相关表达,其细胞的侵袭、穿透、远处迁移等能力均有明显增强。第二部分构建TGF-β1诱导的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24细胞的mRNA和microRNA的表达谱目的构建TGF-β1因子诱导的膀胱尿路上皮癌T24细胞的microRNA表达谱和mRNA的表达谱。方法对TGF-β1诱导的EMT化的膀胱尿路上皮癌T24细胞的总RNA进行提取,并予以质检。质检合格后进行RNA纯化、孵育加尾、标记生物素荧光、芯片杂交、清洗染色、扫描芯片、数据提取以及数据标准化等,所用芯片为目前较为先进GeneChip(?)PrimeView M Human Gene Expression Array芯片以及Multispecies miRNA2.0array芯片。然后注册并利用分子功能注释3.0系统(Capital Bio(?) Molecule Annotation System V3.0, MAS3.0)对芯片结果进行相关分析(如GO, KEGG pathway,靶基因预测,列联分析等等)。结果经10ng/ml TGF-β1因子诱导36小时后的膀胱尿路上皮癌T24细胞共有包括SPC25等在内的1062个基因的表达下调,以及包括ASNS基因在内的572个基因的表达上调。经KEGG pathway平台分析发现,共有包括Cell cycle等在内的40条信号传导通路与之密切相关。利用GO数据库对该基因集进行阐释,共运算出1250条相关的GO信息,其中多与细胞周期、细胞分裂、黏附、代谢调控、免疫反应、运动等密切相关。microRNA芯片扫描结果则显示,microRNA-1184等在内的6个转录本表达下调,而以及包括microRNA-21等在内的8个microRNA的表达上调。MicroRNA芯片与mRNA芯片列联分析发现包括microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638在内的3个microRNAs与部分差异表达的基因的表达趋势存在相关,其中包括ACVR1C、NOG、THBS1、TUBB2A等基因与EMT过程相关性较高。结论获得了TGF-β1诱导的膀胱尿路上皮癌T24细胞系EMT过程中的mRNA以及microRNA的差异表达谱；T24细胞系EMT进程中涉及到包括Cell cycle等在内的多个分子信号通路,这些分子信号通路多与细胞的生长、连接、黏附、运动、侵袭等生物学行为相关；microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638很可能通过靶向调控ACVR1C等基因的方式在T24细胞的EMT进程中发挥作用。第三部分对TGF-β1因子诱导的膀胱尿路上皮癌T24细胞的生物芯片分析结果的验证目的对生物信息学分析的基因芯片及microRNA芯片的结果进行初步的实验室验证,以期提高该分析结果的可信性。方法利用microRNA mimics以及microRNA inhibitor对microRNA进行过表达以及抑制表达。Real-time PCR试验验证三个microRNA的表达趋势是否与芯片结果相同、mimics和inhibitor的表达效果、以及对靶基因表达的调节。划痕试验、Transwell小室迁移实验验证细胞是否发生相应的侵袭、转移等生物学行为的改变。结果PCR结果显示,microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638等microRNAs的表达趋势与芯片结果相同,microRNA的mimics和inhibitor达到预期效果,并且这些microRNAs的靶基因表达与筛选出的生物信息学分析结果相同；划痕试验显示除阴性对照组(N.C.)外的mimics组侵袭能力明显增强,并且各inhibitor组(除inhibitor N.C.组外)的侵袭能力有所减弱。Transwell小室迁移实验提示除阴性对照组(N.C.)外的mimics组迁移转移能力明显增强,inhibitor组的迁移转移能力有所减弱。结论microRNA-21、microRNA-146a以及microRNA-638等可通过靶向调控ACVR1C等基因的方式来在膀胱尿路上皮癌T24细胞的EMT进程中发挥作用,抑制这些microRNAs的表达则可抑制膀胱尿路上皮癌细胞的上皮间质化进程,进而影响其细胞的侵袭、迁移的能力。