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丹参酮类成分是丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）中药效物质基础的重要组成部分,具有重要的医疗和商业价值。生源途径解析是丹参酮类成分研究的热点,近年来已取得重要进展。根据丹参药材辨状论质经验以及前期研究发现,丹参酮类成分主要在根的周皮中积累。此外,我们发现丹参酮类成分在丹参幼根中具有时间发育特异性,即丹参根部由白色向红色的转变过程。以上表明丹参酮类成分具有典型的“时-空”分布现象。基于此,我们提出以下问题:（1）丹参酮类成分“时-空”分布规律的机制和调控机制是什么?（2）丹参酮类成分是否存在特殊的体内转运机制?（3）丹参酮类成分在幼根中逐渐累积且在周皮中定向累积的生物学意义是什么?针对以上问题,本课题应用代谢组分析技术揭示丹参酮类成分“时-空”分布规律,并联合转录组信息阐释丹参酮类成分的“时-空”分布规律机制,整合“时-空”两个维度的信息,挖掘丹参酮类成分转录调控因子和转运蛋白;最终,结合丹参酮ⅡA化感作用的发现,探讨丹参酮类成分“时-空”分布特性的生理意义。主要研究内容包括五部分:1、构建“时-空”代谢图谱,阐明丹参酮类成分合成积累特性:基于UPLC-Q/TOF-MS代谢分析平台对丹参苗期不同发育阶段的根部时间样本和成熟丹参根部不同组织的空间样本进行分析,表征丹参酮类成分的“时-空”分布规律。发现在种子萌发后的一段时期内根中几乎不含丹参酮类成分,在20～25 DAG（Days After Germination）逐渐开始累积,且根部开始有红色点状物分布,在35 DAG丹参酮含量急剧提升,根部变红,因此提出丹参酮类成分在幼苗期呈现从“无”到“有”的累积特性。不同组织分析结果发现丹参酮类成分集中分布在周皮中,韧皮部少量含有,形成层、木质部和初生木质部几乎不含有。以上系统揭示了丹参酮类成分的“时-空”分布规律,并为联合分子数据进一步开展机制研究奠定基础。2、构建丹参根系“时-空”转录图谱:基于高通量测序技术获得丹参“时-空”转录组数据,分析发现丹参酮类成分途径基因的“时-空”表达谱与丹参酮类成分的分布规律一致,即在周皮中高表达,且转录水平在35 DAG明显提升,指出下游通路基因的特异表达是引起丹参酮类成分特异分布的重要机制之一。此外,依据转录组特征可将丹参苗期根部的发育过程分为两个阶段,0～20 DAG为第一阶段,25～40DAG为第二发育阶段,两个阶段差异基因的功能富集结果显示第一阶段主要进行初生代谢过程,第二阶段启动次生代谢产物的合成与代谢过程,如萜类和苯丙烷类。3、发掘丹参酮途径“时-空”特异关键转录调控因子:应用表达谱聚类分析整合“时-空”代谢组及转录组数据,挖掘调控丹参酮类成分生物合成的转录调控因子,发现Sm ERF98和Sm ERF72转录水平与丹参酮的“时-空”分布规律一致,为核表达基因,具典型的转录因子表达特征。联合酵母单杂交、体外凝胶阻滞和双荧光素酶实验证明Sm ERF72可结合KSL1、CYP76AH3、IDI1、HMGR启动子中GCC-box基序并激活转录,Sm ERF98可结合KSL1、CYP76AH3、IDI1启动子中GCC-box基序并激活转录。通过构建过量表达丹参转基因植株,发现Sm ERF72过表达根系中丹参酮途径基因KSL1、CYP76AH3、IDI1、HMGR转录水平显著提高,Sm ERF98引起KSL1、CYP76AH3、IDI1转录水平提升,并导致丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量显著增加,表明Sm ERF98和Sm ERF72具有促进丹参酮ⅡA和隐丹参酮合成的作用。Sm ERF98和Sm ERF72是潜在的调控丹参酮类成分特异分布的转录因子。此外,新的转录因子调控作用的发现将为丹参品质调控及育种提供靶标基因。4、阐释丹参酮ⅡA胞内运输机制:通过显微观察发现,丹参酮类成分具有在胞内合成转运至细胞间隙的现象。ABC转运蛋白家族多与次生代谢产物的转运相关。本研究通过全基因组注释,共获得127条ABC家族转运蛋白基因,分布在8个亚家族,其中ABCG家族成员最多,占总数的46%。联合“时-空”两个维度的转录信息及序列同源性分析,预测Sm ABCG1极有可能参与丹参酮ⅡA的转运过程。表达特征分析显示其定位在细胞膜上,相较于茎、叶、花等器官在根中表达量最高,且转录水平受茉莉酸甲酯的诱导。应用酵母转运功能突变菌株AD1-8的体外转运功能验证,发现Sm ABCG1具有转运丹参酮ⅡA的作用,100μM的丹参酮ⅡA可增加Sm ABCG1蛋白的表达,暗示了Sm ABCG1对丹参酮ⅡA的识别和响应作用;进一步体内功能研究证明过量表达Sm ABCG1后,根系中丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量显著增加。综上结果表明Sm ABCG1极有可能介导丹参酮ⅡA的转运,这一转运蛋白的发现将为揭示丹参酮体内转运过程及特异分布机制提供有力依据,且为丹参基于转运过程开展品质调控工作提供参考。5、丹参酮ⅡA的化感作用评价:丹参酮类成分在周皮胞内特异合成,并转运至胞外,提示其潜在的与外界“交互”的生理作用。此外,发现丹参酮ⅡA可分泌扩散至到根系土壤环境中,且拟南芥在与丹参植株共栽培过程中受到严重抑制,进一步印证了其作用于“体外”的功能特征。为了进一步考察丹参酮ⅡA的生理作用,在无菌条件下使用丹参酮ⅡA处理拟南芥幼苗,发现100μM的丹参酮ⅡA可严重抑制拟南芥根系发育,代谢特征与转录特征均显示出丹参酮ⅡA对拟南芥根系的毒性作用,其中根系生长素含量显著降低有可能是阻碍根系发育的原因之一。以上结果表明丹参酮ⅡA可分泌到根系土壤环境中,极有可能具有抑制其他植物生长发育从而抢占生态位的作用。综上所述,本课题揭示了丹参酮类成分的“时-空”分布规律并阐释其分布规律机制,整合“时-空”两个维度的代谢及转录信息,挖掘丹参酮类成分通路基因转录调控因子Sm ERF98和Sm ERF72、丹参酮ⅡA的体内转运蛋白Sm ABCG1,它们极有可能介导丹参酮类成分生物合成与特异积累过程。此外,发现了丹参酮ⅡA具有抑制拟南芥根系发育的毒性作用,可能是新的化感物质。综上,提出丹参酮类成分在苗期从“无”到“有”逐渐合成,且定向在周皮中累积,由胞内合成转运至胞外,最后分泌至根系土壤环境中抢占生态位的假说。本课题为揭示天然产物生物合成组织特异性、时间特异性的科学内涵提供参考。