【摘 要】
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目的苯并芘（BaP）广泛存在于环境、饮用水和食品中,本研究的目的是关联BPDE导致的滋养细胞功能障碍与流产之间的关系,鉴定新的lncRNA与microRNA,并挖掘差异表达的信号通路,揭示lncRNA和miRNA对信号通路的调控作用,及其在BPDE诱导流产中的功能作用,探索环境有害因素通过滋养层细胞功能障碍而引发流产的分子机制。方法1、采用高通量测序检测BPDE处理的滋养层细胞中差异表达的新lnc
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目的苯并芘（BaP）广泛存在于环境、饮用水和食品中,本研究的目的是关联BPDE导致的滋养细胞功能障碍与流产之间的关系,鉴定新的lncRNA与microRNA,并挖掘差异表达的信号通路,揭示lncRNA和miRNA对信号通路的调控作用,及其在BPDE诱导流产中的功能作用,探索环境有害因素通过滋养层细胞功能障碍而引发流产的分子机制。方法1、采用高通量测序检测BPDE处理的滋养层细胞中差异表达的新lnc-HZ04和新miR-hz04。在BPDE暴露的滋养层细胞及复发性流产绒毛膜组织中,采用RT-qPCR检测lnc-HZ04和miR-hz04的相对表达量。2、采用流式细胞术检测BPDE、lnc-HZ04和miR-hz04对细胞凋亡的功能的作用。3、采用RT-qPCR实验和Western blot实验检测BPDE、lnc-HZ04和miR-hz04对IP3R1/p-CaMKII/SGCB信号通路的影响。4、采用RT-qPCR实验和Western blot实验检测复发性流产绒毛膜组织中IP3R1/p-CaMKII/SGCB信号通路的表达量。5、采用荧光显微镜检测BPDE、lnc-HZ04和miR-hz04对细胞内钙离子释放的影响。6、采用RIP实验检测lnc-HZ04与IP3R1、CaMKII、p-CaMKII与SGCB蛋白相互作用。7、采用RNA稳定性实验检测lnc-HZ04与miR-hz04对IP3R1 mRNA的影响以及miR-hz04对lnc-HZ04的影响。8、采用双荧光素酶报告基因实验、Ago2 RIP实验、MS2-RIP实验和RNA pull-down实验检测miR-hz04与lnc-HZ04,以及miR-hz04与IP3R1 mRNA的相互作用。9、构建BaP染毒小鼠模型,检测BaP对小鼠胚胎吸收率的影响。采用RT-qPCR实验和Western blot实验检测鼠源miR-hz04的表达和鼠源IP3R1/p-Camk2g/Sgcb信号通路的变化。结果1、在流产组织和BPDE暴露的滋养层细胞中lnc-HZ04表达均上调（*p<0.05）,miR-hz04表达量均下调（***p<0.001）。2、流式细胞术结果显示,BPDE和lnc-HZ04均可促进细胞凋亡（*p<0.05）,miR-hz04抑制细胞凋亡（*p<0.05）。3、RT-qPCR和Western blot结果显示,IP3R1、CaMKII、p-CaMKII和SGCB在复发性流产组织中上调表达。BPDE和lnc-HZ04均能上调IP3R1、CaMKII、p-CaMKII和SGCB的表达。miR-hz04抑制IP3R1、CaMKII、p-CaMKII和SGCB的表达。4、荧光显微镜结果显示BPDE和lnc-HZ04均可促进细胞内钙离子释放（*p<0.05）,miR-hz04抑制细胞内钙离子释放（**p<0.01）。5、RIP实验结果表示,IP3R1、CaMKII、p-CaMKII和SGCB与lnc-HZ04没有相互作用。6、RNA稳定性实验结果显示,miR-hz04抑制IP3R1 mRNA和lnc-HZ04的稳定性（*p<0.05）。Lnc-HZ04增加IP3R1 mRNA的稳定性（*p<0.05）。miR-hz04减弱lnc-HZ04对IP3R1 mRNA降解的抑制作用（*p<0.05）。7、双荧光素酶报告基因实验、Ago2 RIP实验、MS2-RIP实验和RNA pull-down实验结果显示,miR-hz04能够与lnc-HZ04直接结合（***p<0.001）,miR-hz04也能与IP3R1 mRNA直接结合（***p<0.001）。同时,lnc-HZ04和IP3R1 mRNA竞争结合miR-hz04（***p<0.001）。8、BaP染毒小鼠模型显示,BaP暴露后小鼠胚胎吸收率增加（**p<0.01）。RT-qPCR和Western blot结果显示,BaP处理孕鼠过后,胎盘组织中鼠源的IP3R1、Camk2g、p-Camk2g和Sgcb的相对表达量随着BaP处理浓度增加而增加。BaP暴露的小鼠组织中miR-hz04的相对表达量下降。结论本研究发现一个新的lnc-HZ04和miR-hz04,BPDE上调lnc-HZ04的表达量,其作为miR-hz04的ce RNA,竞争性地与miR-hz04结合,减弱miR-hz04对IP3R1 mRNA的稳定性及表达水平的抑制,IP3R1表达水平上升,细胞内游离Ca2+的释放增加,激活CaMKII,增加CaMKII磷酸化,然后激活SGCB引发滋养细胞凋亡和流产。
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