目的:疟疾是一种由疟原虫所致,对人类健康及生命安全造成极大危害的虫媒传染病。由于疟原虫在人与蚊双宿主之间传播的复杂特性,疟疾的治疗和预防同样面临着众多挑战。2020年世界疟疾报告中显示,2019年现存约2.29亿疟疾感染病例,40.9万死亡病例。疫苗,一种广泛应用于各类传染病的生物制品,近年来在疟疾中已有长足发展。红前期疫苗,红内期疫苗和传播阻断疫苗是目前国际上研究较为广泛的三种疟疾疫苗,其中传播阻断疫苗（Transmission Blocking Vaccines,TBVs）旨在阻断疟疾在人与蚊宿主间的传播,能够起到大范围的预防保护作用,具有更深远的意义。然而,迄今为止仅有少数几个TBVs候选抗原具有明确的传播阻断活性,也并没有达到完全阻断的效果。疟原虫生命周期的复杂性以及疟原虫逃避免疫反应的机制导致了其表面抗原存在较大变异,单价疫苗免疫效果不理想。因而,研制疟疾复合疫苗是当今的发展趋势。我们的研究选取了前期课题组得到的传播阻断优势候选抗原Pbg37,PSOP25和PSOP26。之前的研究结果表明Pbg37主要表达于疟原虫雄性配子体上,在雄配子体的生成和下一步发育中发挥作用。疟原虫有性阶段动合子表面表达的PSOP25和PSOP26,基因功能分析显示其显著影响动合子的形成,对卵囊数量和蚊感染率有显著影响。我们希望通过不同方式组装并应用这些抗原以实现比单抗原疫苗更高的传播阻断活性。因此,我们设计并表达了由Pbg37和PSOP25两片段以及PSOP25和PSOP26两片段组成的两种融合蛋白。免疫方案上,我们使用单抗原,两种抗原混合以及两种抗原融合蛋白分别免疫小鼠,并对混合或融合抗原免疫反应性,免疫干扰及传播阻断活性进行分析,为开发多抗原和多阶段传播阻断疫苗提供新的指导和理论依据。研究方法:1)疟原虫,小鼠和按蚊。所有动物实验均符合中国医科大学动物伦理委员会要求且经过委员会批准。疟原虫株为P.berghei ANKA 2.34伯氏疟原虫。疟原虫通过尾静脉注射方式在鼠中传代培养,其入侵鼠红细胞后发育增殖。蛋白免疫使用6-8w Balb/c雌性小鼠。按蚊品种为斯氏按蚊（Hor株）,饲养条件为温度25℃,湿度60-70%。2)蛋白表达载体构建。蛋白表达片段为各基因截短区域（Pbg37:26-88 aa,PSOP25:45-245 aa,PSOP26:50-254 aa）。提取疟原虫基因组DNA或者总RNA反转录为c DNA作为基因扩增模板,设计引物后通过PCR方法得到Pbg37、PSOP25和PSOP26片段,之后通过Overlap PCR方法扩增得到Pbg37-PSOP25和PSOP25-PSOP26融合片段。原核蛋白表达载体pET32a（+）和PCR获得的片段均使用限制性内切酶Bam H I和Not I进行消化处理,使用连接酶连接载体和片段,构成原核蛋白表达重组载体。3)蛋白的表达和纯化。将序列鉴定正确后的质粒转化至Rosetta-gami B（DE3）菌株中进行蛋白表达。菌液在20℃条件下经浓度为1m M的IPTG诱导8小时后,高速离心回收细菌。之后使用Ni树脂胶特异性结合含His标签的表达蛋白。纯化蛋白检测纯度和浓度后备用。4)实验动物免疫方案纯化蛋白按如下方案进行免疫小鼠（n=5）,各免疫组使用重组蛋白分别为:1组:PBS对照组;2组:Trx-His标签蛋白免疫组;3组:rPbg37单独免疫组;4组:rPSOP25单独免疫组;5组:rPSOP26单独免疫组,6组:rPbg37+rPSOP25混合免疫组;7组:rPSOP25+rPSOP26混合免疫组;8组:rPbg37-PSOP25融合免疫组;9组:rPSOP25-PSOP26融合免疫组。诱导纯化50μg的重组蛋白混合等体积的完全弗氏佐剂乳化后,以皮下注射方式打入小鼠体内。免疫间隔为14天。免疫14天后,使用25μg纯化后的蛋白等体积混合不完全弗氏佐剂,混合乳化后进行两次增强免疫。最终免疫后14天收集血清,并检测抗体滴度。5)免疫血清识别疟原虫天然抗原情况。为了检测天然疟原虫蛋白与血清的特异性反应,我们应用蛋白免疫印迹和间接免疫荧光实验观察血清能否识别疟原虫天然抗原。Western Blot实验采用配子体和动合子时期抗原提取物与各免疫组抗血清反应,通过ECL化学发光法检测血清与天然蛋白反应情况;IFA实验通过使用各免疫组小鼠抗血清孵育结合各时期疟原虫,采用荧光抗体标记,在Nikon共聚焦显微镜下拍摄观察抗体结合情况。6)传播阻断能力评估我们通过体外动合子形成和蚊喂养实验评估各组抗血清传播阻断能力。体外实验中,我们以1:5和1:10（V/V）的稀释条件,将血清融入培养基。在25℃条件下,雄配子体加入培养基培养15min后,检测雄性配子体出丝情况,并继续在19℃培养24小时后检测动合子形成情况。蚊喂养实验中,经蛋白免疫的各组小鼠末次免疫14天后,小鼠经苯肼治疗处理,再经腹腔注射感染疟原虫,感染后3天,通过按蚊叮咬小鼠的方式将疟原虫摄入体内,血餐12天后,显微镜下解剖按蚊将其中肠取出,溴酚红染色后显微镜下观察中肠上卵囊数。我们通过计算感染疟原虫的按蚊占总按蚊的百分比,以及感染的按蚊中肠中卵囊密度综合评估抗血清传播阻断活性。7)统计学差异分析相关数据采用SPSS23.0软件进行统计学差异分析。采用方差分析方法分析抗体效价、雄性配子体出丝中心和动合子形成数量等多组间差异。Mann-Whitney U检验分析组间卵囊数量差异。组间蚊感染率分析采用Fisher确切概率法。数据用平均值（Mean）±标准误（SEM）表示。检验水准为α=0.05。结果:1)Pbg37-PSOP25和PSOP25-PSOP26原核蛋白表达。我们使用课题组之前筛选出的已证明具有传播阻断活性的多个候选抗原组成新的融合抗原,其中包括表达于疟原虫配子体时期的Pbg37和表达在动合子阶段的PSOP25和PSOP26。首先我们构建了两种融合抗原的蛋白表达载体,一个是组装了主要表达于疟原虫配子体阶段的Pbg37和主要表达于疟原虫动合子阶段的PSOP25,构成不同阶段抗原融合表达载体:Pbg37-PSOP25。另一个选择均主要表达在动合子阶段的PSOP25和PSOP26,构成了同阶段不同位点抗原融合表达载体:PSOP25-PSOP26。我们延用了三个抗原前期研究采用的表达位点,分别为Pbg37:26-88aa（63aa）,PSOP25:45-245aa（201aa）和PSOP26:50-254aa（205aa）,拟构建通过柔性linker（15aa）串联连接的融合蛋白:Pbg37-PSOP25（63aa+15aa+201aa）和PSOP25-PSOP26（201aa+15aa+205aa）。构建成功的两个融合质粒含His标签,其成功转化并表达后,SDS-PAGE和WB结果分析表明,rPbg37-PSOP25和rPSOP25-PSOP26两融合蛋白分子量符合预期大小,分别为51kDa和66kDa。2)各免疫组血清抗体滴度检测。使用Ni-NTA纯化后的各重组蛋白分别免疫小鼠,在第三次免疫14天后采集鼠血并分离得到鼠血清,通过ELISA方法检测血清中的抗体滴度。结果显示,单独抗原免疫小鼠后所得抗血清仅针对各自蛋白发生特异性反应,混合和融合蛋白免疫小鼠后所得抗血清,可与两个单独抗原发生同效价抗原抗体结合反应,且抗体滴度均可达到1:128000,表明混合或融合后的抗原无免疫干扰现象。同时,我们采用蛋白免疫印迹实验评估了免疫血清的特异性。单独抗原免疫血清可与融合蛋白反应。混合和融合抗原免疫血清也可与单独抗原产生特异性条带。结果表明免疫抗原在小鼠体内引发了强烈的免疫应答并且产生的抗体特异性较强。3)混合和融合蛋白诱导产生的多克隆抗体可以特异性结合疟原虫天然蛋白。首先我们采用Western Blot方法检测混合和融合蛋白免疫小鼠产生的多克隆抗体是否能与疟原虫天然蛋白发生反应。等量的配子体和动合子蛋白裂解提取物经SDS-PAGE凝胶电泳分离后,转印至PVDF膜上,后分别与各实验组所得抗血清孵育,检测蛋白免疫印迹。结果显示,抗rPbg37鼠血清与配子体,动合子的裂解提取物反应识别出大小为～37kDa的蛋白条带;rPSOP25和rPSOP26鼠血清与动合子的裂解提取物反应分别识别出大小为～40kDa和～91kDa的蛋白条带;与抗rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25血清结合反应后,配子体裂解提取物识别显示一条蛋白条带,大小为～37kDa,动合子裂解提取物识别显示两条蛋白条带,大小分别为～40kDa和～37kDa;与抗rPSOP25-PSOP26血清结合反应后,仅有动合子裂解提取物识别显示两条蛋白条带,大小分别为～91kDa和～40kDa。其次,我们采用IFA实验验证各组抗血清与疟原虫天然蛋白结合情况。结果显示,无性阶段疟原虫孵育各组抗血清后,镜下均未检测到荧光信号;配子体阶段疟原虫孵育抗rPbg37,rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25鼠血清后,镜下可见明显荧光信号,且采用雌雄配子体特异性标记抗体区分雌雄配子体后,以上3种抗血清孵育后的雄性配子体荧光信号明显强于雌性配子体。同样检测rPSOP25,rPSOP26,rPSOP25+rPSOP26和rPSPO25-PSOP26抗血清与配子体孵育后未见明显荧光信号。动合子阶段疟原虫孵育抗rPSOP25,rPSOP26,rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSPO25-PSOP26鼠血清后,均检测到较强荧光信号。两实验结果表明,抗rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25鼠血清可与疟原虫有性阶段中配子体和动合子时期天然抗原发生结合,抗rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-POSP26鼠血清仅可与疟原虫有性阶段动合子时期天然抗原发生结合。混合或融合免疫后,所产生的多克隆抗体针对所包含单独抗原均产生了免疫应答。4)混合和融合蛋白抗血清具有明显传播阻断活性。我们采用体外和体内实验两种方式验证两种融合蛋白的传播阻断活性。体外实验中雄配子体出丝中心和24小时动合子形成阻断结果显示,相比于Trx-His对照组,抗rPbg37,rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25鼠血清在1:5稀释条件下,雄性配子体出丝相比对照组下降68%,68%和70%,在1:10稀释条件下,雄性配子体出丝相比对照组下降63%,63%和61%。24小时动合子形成阻断结果显示,抗rPbg37,rPSOP25和rPSOP26鼠血清在1:5稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降68%,55%和49%,在1:10稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降60%,53%和42%;抗rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26鼠血清在1:5稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降74%,77%,59%和59%;在1:10稀释条件下,动合子形成数量相比对照组下降65%,67%,55%和56%。蚊喂养实验结果显示,将最终免疫14天后的小鼠感染疟原虫后喂养蚊子,与Trx-His对照组相比,各实验组均显示下降的蚊疟原虫感染率,rPbg37,rPSOP25,rPSOP26,rPbg37+rPSOP25,rPbg37-PSOP25,rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26分别下降了:3%,13%,7%,16%,20%,14%和15%。卵囊密度下降水平分别为:rPbg37:48%,rPSOP25:62%,rPSOP26:52%,rPbg37+rPSOP25:75%,rPSOP25+rPSOP26:66%,rPbg37-PSOP25:77%,rPSOP25-PSOP26:66%。结论:1)混合和融合蛋白免疫所得抗血清均具有较高抗体效价并可识别特定阶段疟原虫天然蛋白,同时,所包含的两抗原间无免疫干扰现象。2)抗混合和融合疫苗抗血清均显示显著的传播阻断能力,且抗rPbg37+rPSOP25和rPbg37-PSOP25鼠血清在阻断蚊胃内卵囊生成的能力上相比两单位点蛋白免疫血清显著升高,蚊感染率方面,混合和融合蛋白免疫血清均显示增强阻断的趋势。抗rPSOP25+rPSOP26和rPSOP25-PSOP26免疫血清在阻断蚊胃内卵囊生成的能力上相比抗rPSOP26免疫血清显著升高;蚊感染率方面,混合和融合蛋白免疫血清均仅显示增强阻断的趋势。3)多时期多位点疫苗传播阻断活性强于同时期多位点疫苗。