研究一血清内脂素水平与非创伤性股骨头坏死的相关性研究目的:通过对比非创伤性股骨头坏死（Non-trumatic osteonecrosis of the femoral head,NONFH）患者与健康者的血清内脂素水平之间的差异,分析NONFH患者血清内脂素与国际骨循环研究协会（Association Research Circulation Osseous,ARCO）分期、视觉模拟评分（Visual Analogue Scale,VAS）和Harris髋关节评分等临床参数的相关性,为NONFH的早期诊断、病情预测和靶点治疗提供一定的科学依据。方法:回顾性选取自2020年7月28日至12月17日在本院确诊的93例NONFH患者和61例健康者。收集所有受试者的一般资料,包括性别、年龄、身高、和体重等。收集NONFH患者ARCO分期、Harris髋关节评分和VAS评分等临床资料。采用ELISA法检测所有受试者血清内脂素浓度。对比NONFH患者和健康者血清内脂素水平,分析NONFH患者血清内脂素水平与临床资料（包括ARCO分期、VAS评分和Harris评分等）的相关性。绘制ROC诊断曲线,计算曲线下面积（area under curve,AUC）评价血清内脂素对NONFH的诊断准确性。结果:与健康组受试者相比,NONFH患者的血清内脂素水平显著降低（P<0.01）。通过Spearman相关性分析,内脂素与病程之间具有显著的负相关性（r=-0.217,P<0.05）;内脂素与Harris评分之间显著正相关（r=0.363,P<0.01）;内脂素与VAS具有显著的负相关性（r=-0.309,P<0.01）。通过绘制ROC曲线来检测血清内脂素对NONFH的诊断准确性。当血清内脂素临界值为2.750 ng/m L时,AUC最大,此时敏感性为75.40%,特异性为79.60%,AUC为0.823（95%CI 0.753-0.892）。结论:血清内脂素水平在NONFH患者中显著低于健康者,与病程、VAS呈显著负相关,与Harris评分呈显著正相关,是诊断NONFH的潜在的生化指标。研究二内脂素对地塞米松诱导的成骨前体细胞的成骨分化和凋亡的影响目的:糖皮质激素是诱发股骨头坏死的主要原因之一,地塞米松（Dexamethasone,Dex）作为最常用的一种糖皮质激素可导致成骨细胞凋亡和抑制成骨,而治疗Dex引起的骨坏死的药物有限。目前尚无文献报道内脂素对Dex诱导的成骨前体细胞系MC3T3-E1凋亡和成骨抑制的研究。本研究旨在探讨内脂素对Dex诱导的成骨前体细胞系MC3T3-E1凋亡和成骨抑制的治疗作用及其作用机制。方法:实验选用小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1。首先,采用CCK-8法测定不同浓度（1μM、10μM和100μM）的Dex和不同浓度（1 n M、10 n M和100 n M）的内脂素处对细胞增殖活力的影响,选取10μM Dex诱导细胞,选取1 n M、10 n M内脂素对细胞进行干预。根据干预措施的不同将细胞分为以下4组:1)对照组;2)Dex组;3)1 n M内脂素+Dex组;4)10 n M内脂素+Dex组。Annexin V-FITC/PI检测各组的细胞凋亡率。ALP检测试剂盒检测各组的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性。Western Blot检测各组Runx-2、Osx、OPN、Bcl-2、Bax蛋白的表达。为进一步探讨内脂素的促成骨分化机制是否通过Akt/Runx-2信号通路,使用Akt特异性抑制剂MK-2206预处理细胞,Western Blot检测对照组、Dex组、内脂素+Dex组和MK-2206+内脂素+Dex组p-Akt和Akt蛋白的表达。结果:1.Dex降低MC3T3-E1细胞的增殖活力。采用CCK-8法测定96孔板中不同浓度（1μM、10μM和100μM）的Dex对细胞增殖活力的影响。结果显示,与对照细胞孔相比较,1μM、10μM和100μM Dex孔增殖活力值均显著降低（P<0.01）;与1μM Dex孔比较,10μM和100μM Dex孔的增殖活力值均显著降低（P<0.01）;与10μM Dex孔比较,100μM Dex孔内增殖活力值略降低,但无显著性差异（P>0.05）。采用CCK-8法测定10μM Dex不同时间点（8 h、16 h和24 h）对细胞殖活力的影响。结果显示,与Dex干预前比较,Dex干预8 h的增殖活力值降低,但无显著性差异（P>0.05）,16 h和24 h的增殖活力值显著降低（P<0.01）;与Dex干预8 h比较,Dex干预16 h和24 h的增殖活力值显著降低（P<0.01）;与Dex干预16 h比较,Dex干预24 h的增殖活力值显著性降低（P<0.01）。以上结果提示,1μM-100μM Dex可降低MC3T3-E1细胞的增殖活力,呈剂量、时间依赖性。2.内脂素提高MC3T3-E1细胞的增殖活力。采用CCK-8法测定不同浓度（1 n M、10 n M和100 n M）的内脂素处对细胞增殖活力的影响。结果显示,与对照细胞孔比较,1 n M、10 n M和100 n M内脂素孔的增殖活力值均有升高,但均无显著性差异（P>0.05）;与1 n M内脂素孔比较,10 n M和100 n M内脂素内脂素孔的增殖活力值均有升高,但均无显著性差异（P>0.05）;与10 n M内脂素孔比较,100 n M内脂素孔内增殖活力值降低,但无显著性差异（P>0.05）。采用CCK-8法测定10 n M内脂素不同时间点（8h、16 h和24 h）对细胞殖活力的影响。与内脂素干预前比较,干预8 h、16 h的增殖活力值均显著性升高（P<0.01）,干预24 h的增殖活力值升高,但无显著性差异（P>0.05）;与干预8 h比较,干预16 h和24 h的增殖活力值均有显著性升高（P<0.01）;与干预16 h比较,干预24 h的增殖活力值有显著性升高（P<0.05）。以上结果提示,1 n M-100 n M内脂素可提高MC3T3-E1细胞的增殖活力,呈剂量、时间依赖性。3.内脂素降低Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡率。采用Annexin V-FITC/PI检测各组细胞的凋亡率。结果显示,与对照组比较,Dex组、1 n M内脂素+Dex组和10 n M内脂素+Dex组的细胞凋亡率值均有显著升高（P<0.05）;与Dex组比较,1 n M内脂素+Dex组和10 n M内脂素+Dex组的细胞凋亡率值均有显著性降低（P<0.01）;与1 n M内脂素+Dex组比较,10 n M内脂素+Dex组的细胞凋亡率有显著性降低（P<0.01）。以上结果提示,内脂素可降低Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡率。4.内脂素对Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡蛋白表达的影响。各组Bax/Bcl-2比值比较:与对照组比较,Dex组的Bax/Bcl-2比值有显著性升高（P<0.01）,1 n M内脂素+Dex组、10 n M内脂素+Dex组的Bax/Bcl-2比值均有显著降低（P<0.05）;与Dex组比较,1 n M内脂素+Dex组、10 n M内脂素+Dex组的Bax/Bcl-2比值均有显著性降低（P<0.01）;与1 n M内脂素+Dex组比较,10 n M内脂素+Dex组的Bax/Bcl-2比值有显著性降低（P<0.05）。以上结果提示,内脂素可能通过调节Bax/Bcl-2以降低Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡率。5.内脂素提高Dex诱导的MC3T3-E1细胞的ALP活性。采用ALP检测试剂盒测定各组的ALP活性。结果显示,与对照组比较,Dex组的ALP活力值降低,但无显著性差异（P>0.05）,1 n M内脂素+Dex组、10 n M内脂素+Dex组的ALP活力值有显著性升高（P<0.01）;与Dex组比较,1 n M内脂素+Dex组和10 n M内脂素+Dex组的ALP活力值显著性升高（P<0.01）;与1 n M内脂素+Dex组比较,10 n M内脂素+Dex组的ALP活力显著性升高（P<0.01）。以上结果提示,内脂素可提高Dex诱导的MC3T3-E1细胞的ALP活性,呈剂量依赖性。6.内脂素促进Dex诱导的MC3T3-E1细胞的成骨蛋白的表达。1)各组Runx-2蛋白表达量比较:与对照组比较,Dex组、1 n M内脂素+Dex组和10 n M内脂素+Dex组的Runx-2蛋白表达量均显著性降低（P<0.05）;与Dex组比较,1 n M内脂素+Dex组和10 n M内脂素+Dex组的Runx-2蛋白表达量均显著性降低（P<0.01）;与1 n M内脂素+Dex组比较,10 n M内脂素+Dex组的Runx-2蛋白表达量显著性降低（P<0.05）。2)各组Osx蛋白表达量比较:与对照组比较,Dex组的Osx蛋白表达量显著性降低（P<0.05）,1 n M内脂素+Dex组、10 n M内脂素+Dex组的Osx蛋白表达量均降低,但均无显著性差异（P>0.05）;与Dex组比较,1 n M内脂素+Dex组的Osx蛋白表达量降低,但无显著性差异（P>0.05）,10 n M内脂素+Dex组的Osx蛋白表达量显著性降低（P<0.01）;与1 n M内脂素+Dex组比较,10 n M内脂素+Dex组的Osx蛋白表达量降低,但无显著性差异（P>0.05）。3)各组OPN蛋白表达量比较:与对照组比较,Dex组的OPN蛋白表达量有显著性降低（P<0.01）,1 n M内脂素+Dex组、10 n M内脂素+Dex组的OPN蛋白表达量均有降低,但均无显著性差异（P>0.05）;与Dex组比较,1 n M内脂素+Dex组、10 n M内脂素+Dex组的OPN蛋白表达量均显著性降低（P<0.05）;与1 n M内脂素+Dex组比较,10 n M内脂素+Dex组的OPN蛋白表达量,但无显著性差异（P>0.05）。以上结果提示,内脂素可促进Dex诱导的MC3T3-E1细胞的成骨相关蛋白Runx-2、Osx、OPN的表达。7.内脂素可能通过Akt/Runx-2信号通路调节成骨表达。1)各组p-Akt/Akt比值比较分析:与对照组比较,Dex组、MK-2206+内脂素+Dex组细胞的p-Akt/Akt比值均有显著性降低（P<0.05）,内脂素+Dex组细胞的p-Akt/Akt比值显著性增高（P<0.05）;与Dex组比较,内脂素+Dex组细胞的p-Akt/Akt比值显著性增高（P<0.05）,MK-2206+内脂素+Dex组细胞的p-Akt/Akt比值有显著性降低（P<0.05）;与内脂素+Dex组比较,MK-2206+内脂素+Dex组细胞p-Akt/Akt比值有显著性降低（P<0.05）。4)与对照组比较,Dex组、MK-2206+内脂素+Dex组细胞的Runx-2蛋白表达量均有显著性降低（P<0.05）,内脂素+Dex组细胞的Runx-2蛋白表达量显著性增高（P<0.05）;与Dex组比较,内脂素+Dex组细胞的Runx-2蛋白表达量显著性增高（P<0.05）,MK-2206+内脂素+Dex组细胞的Runx-2蛋白表达量显著性降低（P<0.05）;与内脂素+Dex组比较,MK-2206+内脂素+Dex组细胞的Runx-2蛋白表达量显著性降低（P<0.05）。以上结果提示,内脂素可能通过提高Akt的磷酸化激活Akt/Runx-2信号通路以促进下游成骨表达。结论:内脂素可提高MC3T3-E1细胞的增殖活力,降低Dex诱导细胞的凋亡率,提高Dex诱导细胞的ALP活性,可能通过激活Akt/Runx-2信号通路上调MC3T3-E1细胞的成骨标志物Runx-2、Osx、OPN蛋白的表达水平,是激素导致的骨坏死的潜在有效治疗药物。研究三肉桂酸对地塞米松诱导的成骨前体细胞成骨分化及对内脂素表达的影响目的:诸多研究把内脂素作为治疗靶点,通过药物调节内脂素的水平来达到治疗疾病的目的。肉桂酸在骨代谢平衡中发挥着重要的作用,目前,尚无文献报道肉桂酸对Dex诱导后的MC3T3-E1细胞成骨分化和内脂素水平的影响。本研究旨在探讨肉桂酸对MC3T3-E1细胞成骨分化及对内脂素水平的影响。方法:实验选用小鼠成骨前体细胞系MC3T3-E1。采用CCK-8法检测不同浓度（0.03 m M、0.3 m M和3 m M）肉桂酸对MC3T3-E1成骨前体细胞增殖活力的影响。细胞根据干预措施的不同分为4组:1)对照组;2)Dex组;3)0.3 m M肉桂酸+Dex组;4)3m M肉桂酸+Dex组。使用ALP活性检测试剂盒检测肉桂酸对Dex诱导后MC3T3-E1成骨前体细胞ALP活性的影响。PCR、Western Blot检测肉桂酸对Dex诱导后MC3T3-E1成骨前体细胞Visfatin、Runx-2、Osx、OPN m RNA及其蛋白表达水平的影响。结果:1.肉桂酸降低MC3T3-E1细胞的增殖活力。CCK-8法测定不同浓度（0.03 m M、0.3 m M和3 m M）肉桂酸在24 h的增殖活力值。结果显示,与对照孔比较,0.03 m M、0.3 m M肉桂酸增殖活力值降低,但无显著性差异（P>0.05）,3 m M肉桂酸增殖活力值显著性降低（P<0.01）;与0.03 m M肉桂酸比较,0.3 m M肉桂酸的增殖活力值降低,但无显著性差异（P>0.05）,3 m M肉桂酸的增殖活力值显著性降低（P<0.01）;与0.3 m M肉桂酸比较,3 m M肉桂酸内增殖活力值降低,但无显著性差异（P>0.05）。采用CCK-8法检测3 m M肉桂酸不同时间点（8 h、16 h和24 h）增殖活力值,结果显示,与肉桂酸干预前比较,干预8 h的增殖活力值降低,但无显著性差异（P>0.05）;干预16 h、24 h的增殖活力值均显著性降低（P<0.01）;与干预8 h比较,干预16 h和24 h的增殖活力值均显著性降低（P<0.01）;与干预16 h比较,干预24 h的增殖活力值有显著性降低（P<0.05）。以上结果提示,肉桂酸可降低MC3T3-E1细胞的增殖活力,呈剂量、时间依赖性。2.肉桂酸提高MC3T3-E1细胞的ALP活性。结果显示,与对照组比较,Dex组的ALP活力值显著性降低（P<0.01）,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组的ALP活力值均显著性降低（P<0.01）;与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组的ALP活力值均显著性升高（P<0.05）;与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3 m M肉桂酸+Dex组的细胞ALP活力值升高,但无显著性差异（P>0.05）。以上结果提示,肉桂酸可提高MC3T3-E1细胞的ALP活性。3.肉桂酸降低Dex诱导的MC3T3-E1细胞内脂素蛋白的表达。Western blot结果显示,与对照组比较,Dex组的内脂素蛋白表达量显著性升高（P<0.01）,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组的内脂素蛋白表达量均显著性升高（P<0.05）;与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组的内脂素蛋白表达量显著性降低（P<0.05）;与0.3 m M肉桂酸组+Dex比较,3 m M肉桂酸+Dex组的内脂素蛋白表达量显著性降低（P<0.05）。以上结果提示,肉桂酸可降低Dex诱导的MC3T3-E1细胞内脂素蛋白的表达。4.肉桂酸降低Dex诱导后MC3T3-E1细胞内脂素m RNA的水平。PCR结果显示,与对照组比较,Dex组、0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组内脂素m RNA表达量均显著升高（P<0.05）。与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组内脂素m RNA表达量均显著性降低（P<0.05）。与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3 m M肉桂酸+Dex组内脂素m RNA表达量显著性降低（P<0.05）。以上结果提示,肉桂酸可降低Dex诱导后MC3T3-E1细胞内脂素m RNA的水平。5.肉桂酸提高Dex诱导后MC3T3-E1细胞成骨相关因子m RNA的水平。PCR结果显示,1)各组Runx-2 m RNA表达量比较:与对照组比较,Dex组、0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组Runx-2 m RNA表达量均有显著性降低（P<0.05）。与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组Runx-2 m RNA表达量均显著性增高（P<0.01）。与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3 m M肉桂酸+Dex组细胞Runx-2 m RNA表达量有显著性增高（P<0.05）。2)各组Osx m RNA表达量比较:与对照组比较,Dex组、0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组Osx m RNA表达量均显著性增高（P<0.05）。与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组细胞Osx m RNA表达量均显著性增高（P<0.05）。与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3m M肉桂酸+Dex组细胞Osx m RNA表达量有显著性增高（P<0.05）。3)各组OPN m RNA表达量比较:与对照组比较,Dex组、0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组的OPN m RNA表达量均显著性增高（P<0.05）。与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组细胞OPN m RNA表达量均显著性增高（P<0.05）。与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3 m M肉桂酸+Dex组细胞OPN m RNA表达量有显著性增高（P<0.05）。以上结果提示,肉桂酸可提高Dex诱导后MC3T3-E1细胞成骨相关因子Runx-2、Osx、OPN m RNA的水平。6.肉桂酸提高Dex诱导后MC3T3-E1细胞成骨标志蛋白的表达。Western blot结果显示,1)各组Runx-2蛋白表达量比较:与对照组比较,Dex组、0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组Runx-2蛋白表达量均有显著性降低（P<0.05）。与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组Runx-2蛋白表达量均显著性增高（P<0.05）。与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3 m M肉桂酸+Dex组细胞Runx-2蛋白表达量显著性增高（P<0.05）。2)各组Osx蛋白表达量比较:与对照组比较,Dex组、0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组Osx蛋白表达量均显著性增高（P<0.05）。与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组细胞Osx蛋白表达量均显著性增高（P<0.05）。与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3 m M肉桂酸+Dex组组细胞Osx蛋白表达量显著性增高（P<0.05）。3)与对照组比较,Dex组、0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组OPN蛋白表达量均显著性增高（P<0.05）。与Dex组比较,0.3 m M肉桂酸+Dex组、3 m M肉桂酸+Dex组细胞OPN蛋白表达量均显著性增高（P<0.05）。与0.3 m M肉桂酸+Dex组比较,3 m M肉桂酸+Dex组组细胞OPN蛋白表达量显著性增高（P<0.05）。以上结果提示,肉桂酸提高Dex诱导后MC3T3-E1细胞成骨标志蛋白Runx-2、Osx、OPN的表达。结论:肉桂酸可抑制MC3T3-E1成骨前体细胞增殖活力,增高Dex诱导的MC3T3-E1成骨前体细胞的ALP活性以及成骨相关因子Runx-2、Osx和OPN m RNA和蛋白的表达,并抑制Dex诱导细胞的内脂素m RNA和蛋白的表达。