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目的:
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由激活的巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子,其最显著的特征是在体内外直接杀伤肿瘤细胞,是一种具有潜在应用价值的抗肿瘤生物制剂。随着分子生物学技术的飞速发展,应用基因工程手段制备高效低毒的hTNF-α突变体和具肿瘤靶向性的TNF-α融合蛋白呈现出较好的应用前景。本课题根据肿瘤组织一般高分泌MMPs特点,构建MMPs介导的肿瘤靶向性rhTNF-α融合蛋白表达质粒,使融合蛋白特异性地靶向于肿瘤组织,肿瘤组织高浓度的MMPs水解其底物序列,暴露出hTNF-α受体结合部位。hTNF-α与其受体结合后,诱发一系列的细胞凋亡信号转导途径,从而杀伤肿瘤细胞。
方法:
1.构建pET-42a(+)-foldon载体
合成含有foldon序列的引物,对pET-42a(+)质粒进行PCR,将PCR产物和pET-42a(+)质粒同时进行双酶切,连接,转化。筛选阳性重组子并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定、双酶切鉴定、PCR鉴定和DNA测序分析。
2.构建四种重组质粒
对本课题组构建好的pET-32a(+)-collagen-MMP1,8a-hTNF-α、pET-32a(+)-collagen-MMP1,8b-hTNF-α、pET-32a(+)-collagen-MMP2,9a-hTNF-α和pET-32a(+)-collagen-MMP2,9b-hTNF-α四种克隆质粒用相对应的引物分别进行PCR,得到的PCR产物片段中分别含有MMP1-hTNF-α、MMP8一hTNF-α、MMP2-hTNF-α、MMP9-hTNF-α,对PCR产物和pET-42a(+)-foldon质粒同时进行双酶切,连接,转化。筛选阳性重组子并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定、双酶切鉴定、DNA测序分析。
四种重组质粒质粒分别命名为:pET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-goldon-MMP9-hTNF-α;
3.蛋白表达产物的鉴定及条件的优化
用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导蛋白表达,对产物进行SDS-PAGE检测。在蛋白基本表达的基础上,对诱导温度、诱导剂浓度及表达时间等条件进行优化,按照Novagen公司蛋白提取试剂盒(BugBuster Protein Extraction Reagent)方法进行提取,分别收集上清和沉淀中融合蛋白,进行SDS-PAGE检测,然后利用Bandscan软件分析,确定融合蛋白的可溶性表达条件。
4.蛋白纯化
1)按照Novagen公司GST-Bind Resin试剂盒方法纯化融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的纯化产物。
2)纯化蛋白总含量的测定。
按Bradford酶标板蛋白测定法检测纯化产物的含量。
3)用凝血因子(Factor Xa)切除载体标签
5.基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-8和MMP-2、MMP-9)对融合蛋白的去封闭效果研究
分别用MMP-1、MMP-8、MMP-2和MMP-9酶切相对应的融合蛋白,SDS-PAGE鉴定酶切条带。
6.融合蛋白生物学活性的初步研究
以hTNF-α标准品为参照,对带有GST标签的融合蛋白(即GST-foldon-MMP1-hTNF-α)、切除GST标签的融合蛋白(即foldon-MMP1-h1NF-α)、经MMP1酶切的融合蛋白(即rhTNF-α),利用MTT检测融合蛋白的细胞毒性。
结果:
1.成功构建TpET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、
pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和
pET-42a(+)-foldon-MMP9-hTNF-α四种质粒;2.确立了pET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-foldon-MMP9hTNF-α四种质粒在大肠杆菌Rosetta2(DE3)的表达条件,实现了四种hTNF-α融合蛋白的高效、可溶性表达。
3.确定了融合蛋白的纯化方案,成功切除了融合蛋白上的载体标签。
4.初步验证了基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-8和MMP-2、MMP-9)对融合蛋白的去封闭效果。
5.融合蛋白具有细胞毒作用,能诱导肿瘤细胞凋亡。
结论:
构建了四种基质金属蛋白酶介导的肿瘤靶向性rhTNF-α融合蛋白表达载体,优化了其在大肠杆菌系统中表达的条件,实现了高效、可溶性表达;获得了切除载体标签后的四种融合蛋白,四种融合蛋白能诱导高表达MMPs的肿瘤细胞凋亡。