论文部分内容阅读
目的:
以三七总皂苷白蛋白微球(PNS-BSA-MS)为研究对象，探讨将其制成注射齐的介质和附加剂的筛选、质量标准、体外稳定性、体外释放度以及体内药动学，并对其治疗家兔骨性关节炎(OA)的疗效进行初步考查。以期为OA的治疗提供新的思路。
方法:
1.利用光学显微镜观察微球粒径的大小与分布、用漏斗法测定休止角(θ)来表征其流动性、采用激光粒度分析仪测量微球粒径大小，采用细准焦螺旋测定微球的形变率来评价其机械强度，并采用星点设计法，在单因素试验的基础上，以沉降体积比为考察指标，选取微球用量、透明质酸钠溶液的浓度进行两因素三水平的响应曲面法对PNS-BSA-MS注射剂制备工艺进行优化。
2.按照《中国药典》2015版制剂通则下对注射剂的质量要求对PNS-BSA-MS注射剂进行性状、粒径、PH值、装量、沉降体积比、鞣质、树脂、细菌内毒素及可见异物进行检查;并采用高效液相色谱，用梯度洗脱方法，测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，建立PNS-BSA-MS注射剂的含量测定方法，并进行方法学考察。
3.通过影响因素试验考察PNS-BSA-MS注射剂在高温、冷藏、冷冻条件下的稳定性;通过加速稳定性试验考察，考察注射剂中的主要成分随时间变化规律;同时对PNS-BSA-MS注射剂中有关物质进行测定，通过性状检查、pH值检查、有关物质测定、树脂的测定、可见异物测定、微球形态检查，评价其有关物质对其稳定性的影响。
4.根据2015版药典四部附录XD释放度测定法第二法(浆法)，以为pH=6.8的磷酸盐缓冲液200mL为溶出介质，温度为(37±0.5)℃，转速为(100±1)r·min-1来测定其体外释放度。
5.以家新西兰大白兔为模型动物，以血塞通注射液为对照制剂，关节腔注射PNS-BSA-MS注射剂，运用UPLC-MS/MS技术检测家兔体内PNS-BSA-MS注射剂组和血塞通注射剂中人参皂苷Rb1的血浆浓度变化，同时建立人参皂苷Rb1的血浆定量分析方法，以血药浓度、药时曲线，比较两种制剂渗漏进入体循环的药物量，通过药动学参数评价PNS-BSA-MS注射剂的缓释长效作用，探讨PNS-BSA-MS注射剂局部用药的优势。
6.将35只新西兰大白兔兔随机分为正常组、模型组、PNS-BSA-MS组(以水为分散介质)、透明质酸钠注射剂组、PNS-BSA-MS注射剂组(以透明质酸钠为介质)、血塞通注射剂组、空白微球组，除正常组外其余各组均用关:节腔注射4％的木瓜蛋白酶溶液建立家兔膝关节OA模型，正常组、模型组不予任何治疗，其余各组分别采用关节腔注射PNS-BSA-MS、透明质酸钠注射剂、PNS-BSA-MS注射剂、血塞通注射剂、空白微球进行治疗，每周1次，连续给药6周，每次给药前记录兔子的膝关节肿胀情况。于给药结束2周后耳缘静脉处死兔子，取出兔子关节部位，置于10％甲醛溶液中固定保存。分别采用以下方法处理:①造模前、造模后及给药后不同时间膝关节的直径来探讨和比较各给药组对膝骨关节炎的治疗作用。②参照Mankin关节病组织学分类法，对软骨和滑膜进行评价积分。
结果:
1.干燥后的微球外观为淡黄色疏松粉末，流动性良好;光学显微镜下观察微球表面光滑，呈圆形，分散性良好，大小均匀。测定微球平均粒径为9.730μm，PNS-BSA-MS的休止角θ均小于60°，5批微球平均机械强度为0.1818，RSD为3.3％;星点设计试验结果显示，PNS-BSA-MS注射剂制备工艺的最佳制备条件为:当微球用量质量分数为1.5，透明质酸钠溶液质量分数为1，通过验证性试验，测得注射剂的平均沉降体积比为91.37％。RSD=1.4％。
2.注射剂中微球显微图可以看出微球表面圆整度分散性很好，无明显凹陷，用激光粒度分析仪测定的三批注射剂中微球的Dav分别为9.503、9.476、9.415μm，符合规定，其pH值、装量、沉降体积比、鞣质、树脂、细菌内毒素及可见异物检查均符合药典规定。方法学考察项目均达到要求，3批注射剂中微球的总载药量均为6.87％，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.21％、1.1％、0.30％，微球总载药量的RSD0为0.50％。将注射剂微球的载药量限度定为80％-120％，即5.50％-8.24％。
3.通过影响因素试验及加速稳定性试验对PNS-BSA-MS注射剂的稳定性进行考察，结果表明，PNS-BSA-MS注射剂在冷藏条件下的稳定性良好，但在高温条件下性状及含量变化较大，冷冻条件下微球有所粘结:在6个月的加速稳定性试验过程中，PNS-BSA-MS注射剂中主要有效成分三七皂苷R1在试验期间含量变化相对稳定，但是三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量整体呈减小趋势，而pH值、微球形态、可见异物及有关物质等考察指标与0月相比均无明显变化。1个月内注射剂基本都是混悬状态或者不需要很用力震摇就能恢复混悬状态，但从1个月以后微球粘附在安瓿瓶壁上月严重，时间越长需要用力震摇才能让其恢复稳定状态，说明PNS-BSA-MS注射剂不适合常温长时间存放。
4.释放度结果表明三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的体外释放均符合一级释药模型，其方程分别为ln(1-Q)=0.01t-91(r=0.7729)、ln(1-Q)=0.01t-0.53(r=0.9251)、ln(1-Q)=0.01t-0.38(r=0.9099)。在120h时PNS-BSA-MS中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1在磷酸盐缓冲液中的累积溶出率分别为116.24％、78.17％、80.89％，基本符合2015年版《中国药典》规定。
5.建立人参皂苷Rb1血浆体内分析方法，均满足检测要求。通过对比血塞通注射剂组和PNS-BSA-MS注射剂组的血药浓度、药时曲线和药动学参数发现PNS-BSA-MS注射剂组半衰期和平均滞留时间都有延长，PNS-BSA-MS组半衰期为59.350h，血塞通注射剂组半衰期35.694h，明显延长(P＜0.05)，PNS-BSA-MS组平均滞留时间为57.716h，比血塞通注射剂组有所延长，且达到药物浓度峰的时间明显推迟。PNS-BSA-MS组AUC0-∞为2265.702，是血塞通注射剂组的AUC的1.16倍。
6.①造模前，各组之间家兔膝关节直径的均值无明差异(P＞0.05)，但造模后除正常组外各组关节直径均高于造模前。与正常组相比，模型组大白兔的关节肿胀度明显升高(p＜0.05，p＜0.01)。与模型组相比，各给药组关节肿胀度有所下降，其中实验给药第4次起PNS-BSA-MS注射剂组开始有统计学意义(P＜0.05)，PNS-BSA-MS注射剂开始起效;实验第5次起，HA组和血塞通组的关节肿胀度有统计学意义(P＜0.05)HA和血塞通开始起效;而空白微球组和PNS-BSA-MS组给药6次后关节肿胀度与模型组对比依然没有统计学意义(P＞0.05)。以上结果表明PNS-BSA-MS注射剂组能降低大白兔的关节肿胀度(P＜0.05)。②该模型组组织软骨和滑膜病理形态积分总值与正常组相比显著升高(P＜0.01);各给药组软骨和滑膜病理积分总值与模型相组比均有不同程度下降，其中PNS-BSA-MS注射剂组、HA注射剂组、血塞通组软骨和滑膜病理积分结果呈现差异非常显著(P＜0.01);PNS-BSA-MS组、空白微球组软骨和滑膜病理积分总值与模型组相比，结果呈现最著性统计学意义(P＜0.05)。
结论:
PNS-BSA-MS注射剂质量稳定、可控，具有一定的缓释效果，对家兔OA的疗效优于对照组。这为OA的治疗提供了新的思路和手段，具有较高的科学技术价值和临床应用前景。
以三七总皂苷白蛋白微球(PNS-BSA-MS)为研究对象，探讨将其制成注射齐的介质和附加剂的筛选、质量标准、体外稳定性、体外释放度以及体内药动学，并对其治疗家兔骨性关节炎(OA)的疗效进行初步考查。以期为OA的治疗提供新的思路。
方法:
1.利用光学显微镜观察微球粒径的大小与分布、用漏斗法测定休止角(θ)来表征其流动性、采用激光粒度分析仪测量微球粒径大小，采用细准焦螺旋测定微球的形变率来评价其机械强度，并采用星点设计法，在单因素试验的基础上，以沉降体积比为考察指标，选取微球用量、透明质酸钠溶液的浓度进行两因素三水平的响应曲面法对PNS-BSA-MS注射剂制备工艺进行优化。
2.按照《中国药典》2015版制剂通则下对注射剂的质量要求对PNS-BSA-MS注射剂进行性状、粒径、PH值、装量、沉降体积比、鞣质、树脂、细菌内毒素及可见异物进行检查;并采用高效液相色谱，用梯度洗脱方法，测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，建立PNS-BSA-MS注射剂的含量测定方法，并进行方法学考察。
3.通过影响因素试验考察PNS-BSA-MS注射剂在高温、冷藏、冷冻条件下的稳定性;通过加速稳定性试验考察，考察注射剂中的主要成分随时间变化规律;同时对PNS-BSA-MS注射剂中有关物质进行测定，通过性状检查、pH值检查、有关物质测定、树脂的测定、可见异物测定、微球形态检查，评价其有关物质对其稳定性的影响。
4.根据2015版药典四部附录XD释放度测定法第二法(浆法)，以为pH=6.8的磷酸盐缓冲液200mL为溶出介质，温度为(37±0.5)℃，转速为(100±1)r·min-1来测定其体外释放度。
5.以家新西兰大白兔为模型动物，以血塞通注射液为对照制剂，关节腔注射PNS-BSA-MS注射剂，运用UPLC-MS/MS技术检测家兔体内PNS-BSA-MS注射剂组和血塞通注射剂中人参皂苷Rb1的血浆浓度变化，同时建立人参皂苷Rb1的血浆定量分析方法，以血药浓度、药时曲线，比较两种制剂渗漏进入体循环的药物量，通过药动学参数评价PNS-BSA-MS注射剂的缓释长效作用，探讨PNS-BSA-MS注射剂局部用药的优势。
6.将35只新西兰大白兔兔随机分为正常组、模型组、PNS-BSA-MS组(以水为分散介质)、透明质酸钠注射剂组、PNS-BSA-MS注射剂组(以透明质酸钠为介质)、血塞通注射剂组、空白微球组，除正常组外其余各组均用关:节腔注射4％的木瓜蛋白酶溶液建立家兔膝关节OA模型，正常组、模型组不予任何治疗，其余各组分别采用关节腔注射PNS-BSA-MS、透明质酸钠注射剂、PNS-BSA-MS注射剂、血塞通注射剂、空白微球进行治疗，每周1次，连续给药6周，每次给药前记录兔子的膝关节肿胀情况。于给药结束2周后耳缘静脉处死兔子，取出兔子关节部位，置于10％甲醛溶液中固定保存。分别采用以下方法处理:①造模前、造模后及给药后不同时间膝关节的直径来探讨和比较各给药组对膝骨关节炎的治疗作用。②参照Mankin关节病组织学分类法，对软骨和滑膜进行评价积分。
结果:
1.干燥后的微球外观为淡黄色疏松粉末，流动性良好;光学显微镜下观察微球表面光滑，呈圆形，分散性良好，大小均匀。测定微球平均粒径为9.730μm，PNS-BSA-MS的休止角θ均小于60°，5批微球平均机械强度为0.1818，RSD为3.3％;星点设计试验结果显示，PNS-BSA-MS注射剂制备工艺的最佳制备条件为:当微球用量质量分数为1.5，透明质酸钠溶液质量分数为1，通过验证性试验，测得注射剂的平均沉降体积比为91.37％。RSD=1.4％。
2.注射剂中微球显微图可以看出微球表面圆整度分散性很好，无明显凹陷，用激光粒度分析仪测定的三批注射剂中微球的Dav分别为9.503、9.476、9.415μm，符合规定，其pH值、装量、沉降体积比、鞣质、树脂、细菌内毒素及可见异物检查均符合药典规定。方法学考察项目均达到要求，3批注射剂中微球的总载药量均为6.87％，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.21％、1.1％、0.30％，微球总载药量的RSD0为0.50％。将注射剂微球的载药量限度定为80％-120％，即5.50％-8.24％。
3.通过影响因素试验及加速稳定性试验对PNS-BSA-MS注射剂的稳定性进行考察，结果表明，PNS-BSA-MS注射剂在冷藏条件下的稳定性良好，但在高温条件下性状及含量变化较大，冷冻条件下微球有所粘结:在6个月的加速稳定性试验过程中，PNS-BSA-MS注射剂中主要有效成分三七皂苷R1在试验期间含量变化相对稳定，但是三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1含量整体呈减小趋势，而pH值、微球形态、可见异物及有关物质等考察指标与0月相比均无明显变化。1个月内注射剂基本都是混悬状态或者不需要很用力震摇就能恢复混悬状态，但从1个月以后微球粘附在安瓿瓶壁上月严重，时间越长需要用力震摇才能让其恢复稳定状态，说明PNS-BSA-MS注射剂不适合常温长时间存放。
4.释放度结果表明三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的体外释放均符合一级释药模型，其方程分别为ln(1-Q)=0.01t-91(r=0.7729)、ln(1-Q)=0.01t-0.53(r=0.9251)、ln(1-Q)=0.01t-0.38(r=0.9099)。在120h时PNS-BSA-MS中三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1在磷酸盐缓冲液中的累积溶出率分别为116.24％、78.17％、80.89％，基本符合2015年版《中国药典》规定。
5.建立人参皂苷Rb1血浆体内分析方法，均满足检测要求。通过对比血塞通注射剂组和PNS-BSA-MS注射剂组的血药浓度、药时曲线和药动学参数发现PNS-BSA-MS注射剂组半衰期和平均滞留时间都有延长，PNS-BSA-MS组半衰期为59.350h，血塞通注射剂组半衰期35.694h，明显延长(P＜0.05)，PNS-BSA-MS组平均滞留时间为57.716h，比血塞通注射剂组有所延长，且达到药物浓度峰的时间明显推迟。PNS-BSA-MS组AUC0-∞为2265.702，是血塞通注射剂组的AUC的1.16倍。
6.①造模前，各组之间家兔膝关节直径的均值无明差异(P＞0.05)，但造模后除正常组外各组关节直径均高于造模前。与正常组相比，模型组大白兔的关节肿胀度明显升高(p＜0.05，p＜0.01)。与模型组相比，各给药组关节肿胀度有所下降，其中实验给药第4次起PNS-BSA-MS注射剂组开始有统计学意义(P＜0.05)，PNS-BSA-MS注射剂开始起效;实验第5次起，HA组和血塞通组的关节肿胀度有统计学意义(P＜0.05)HA和血塞通开始起效;而空白微球组和PNS-BSA-MS组给药6次后关节肿胀度与模型组对比依然没有统计学意义(P＞0.05)。以上结果表明PNS-BSA-MS注射剂组能降低大白兔的关节肿胀度(P＜0.05)。②该模型组组织软骨和滑膜病理形态积分总值与正常组相比显著升高(P＜0.01);各给药组软骨和滑膜病理积分总值与模型相组比均有不同程度下降，其中PNS-BSA-MS注射剂组、HA注射剂组、血塞通组软骨和滑膜病理积分结果呈现差异非常显著(P＜0.01);PNS-BSA-MS组、空白微球组软骨和滑膜病理积分总值与模型组相比，结果呈现最著性统计学意义(P＜0.05)。
结论:
PNS-BSA-MS注射剂质量稳定、可控，具有一定的缓释效果，对家兔OA的疗效优于对照组。这为OA的治疗提供了新的思路和手段，具有较高的科学技术价值和临床应用前景。