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背景和目的:减轻心肌缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,I/R)仍是现代缺血性心脏病治疗学面临的重要挑战。线粒体是细胞的动力工厂,决定细胞生存与否,大量研究证明心肌保护的各种信号通路最终都以线粒体为靶点。线粒体的生命周期涉及裂解和融合重复循环,为维持细胞正常功能,线粒体在局部融合和裂解中保持连续平衡,分别生成狭长连续或片段分散的线粒体,使细胞免受Ca2+超载、氧化应激、线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)突变引起的损伤。线粒体融合(Mitofusin,MFN)蛋白由外膜的MFN1、MFN2和内膜的视神经萎缩蛋白1(Optic atrophy protein 1,OPA1)组成,线粒体裂解蛋白由胞质的动力相关蛋白1(Dynamin-related protein 1,DRP1)和外膜的人类线粒体裂解蛋白1(Fission protein 1,FIS1)组成。体内外研究证明线粒体融合是维持其正常功能的代偿机制,在减轻心肌I/R中具有重要作用。过表达DRP1、FIS1可提高线粒体通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放的敏感性,而过表达MFN217或抑制DRP118则阻止mPTP的开放。多项研究均显示Notch1信号通路与线粒体融合/裂解存在不同程度的关联。Notch1信号通路通过其胞内段NICD抑制线粒体分裂水平,减轻细胞凋亡。在胃癌及乳腺癌细胞中,LMP2A可通过上调DRP1促进线粒体裂解,而激活Notch1信号通路则会打破线粒体融合-裂解平衡。因此,本论文拟开展Notch1信号通路调控线粒体融合/裂解发挥心肌保护的机制研究,拟采用腺病毒构建等技术,制备相应心肌细胞与大鼠缺血再灌注损伤模型;在心肌和大鼠缺血再灌注损伤模型中确认线粒体融合/裂解发生的基础上,研究不同Notch1表达水平对线粒体融合/裂解蛋白Notch1、MFN1、MFN2、OPA1、DRP1、FIS1的影响;在细胞活力、凋亡方面阐述Notch1调控融合/裂解减轻心肌I/R的生理作用;采用双荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀、凝胶迁移技术探讨Notch1、MFN1、DRP1间交互作用,从中探讨Notch1阻滞线粒体裂解,抑制mPTP开放的分子机制;最后在整体动物实验上进行进一步的比较论证,力求阐明Notch1信号通路促进线粒体融合,抑制线粒体裂解的心肌保护作用的分子机理,为临床心肌缺血再灌注损伤保护策略提供新的理论依据,实现缺血性心脏病的整体治疗水平的提高。材料和方法:1.Notch1通过抑制线粒体裂解减轻心肌细胞缺血再灌注损伤(1)选用SPF级雄性SD大鼠(体重300±25 g),从SD大鼠(1天大)中分离新生大鼠心肌细胞。利用pAdeasy TM载体系统制备了表达NICD互补DNA(cDNA)的重组腺病毒感染原代心肌细胞,病毒感染复数MOI=50。(2)95%N2和5%CO2充分饱和缺氧缓冲液,5%CO2、95%O2充分饱和复氧缓冲液构建心肌细胞H/R模型。(3)CCK-8法检测腺病毒NICD转染H/R心肌细胞的细胞活力。(4)激光共聚焦显微镜(Laser confocal microscope,LSCM)检测腺病毒NICD转染H/R心肌细胞线粒体融合/裂解。(5)流式细胞仪检测腺病毒NICD转染H/R心肌细胞的细胞凋亡。(6)流式细胞仪测定腺病毒NICD转染H/R心肌细胞的ΔΨm。(7)Western blot检测腺病毒NICD转染H/R心肌细胞中MFN1、MFN2、NICD、OPA1、DRP1、FIS1、Cytochrome c、ANT、Cyp-d、PiC和VDAC蛋白的表达。2.Notch1通过调节MFN1和DRP1的表达减轻心肌细胞缺血再灌注损伤(1)选用SPF级雄性SD大鼠(体重300±25 g),从SD大鼠(1天大)中分离新生大鼠心肌细胞。利用pAdeasy TM载体系统制备了表达NICD、MFN1和DRP1互补DNA(cDNA)的重组腺病毒感染原代心肌细胞,病毒感染复数MOI=50。(2)95%N2和5%CO2充分饱和缺氧缓冲液,5%CO2、95%O2充分饱和复氧缓冲液构建心肌细胞H/R模型。(3)CCK-8法检测腺病毒NICD、MFN1和DRP1转染H/R心肌细胞的细胞活力。(4)激光共聚焦显微镜(Laser confocal microscope,LSCM)检测腺病毒NICD、MFN1和DRP1转染H/R心肌细胞线粒体融合/裂解。(5)流式细胞仪检测腺病毒NICD、MFN1和DRP1转染H/R心肌细胞的细胞凋亡。(6)流式细胞仪测定腺病毒NICD、MFN1和DRP1转染H/R心肌细胞的ΔΨm。(7)Western blot检测腺病毒NICD、MFN1和DRP1转染H/R心肌细胞中MFN1、MFN2、NICD、OPA1、DRP1、FIS1、Cytochrome c、ANT、Cyp-d、PiC和VDAC蛋白的表达。3.转录因子RBP-Jκ激活MFN1在心肌细胞缺血再灌注损伤细胞中的表达(1)选用SPF级雄性SD大鼠(体重300±25 g),从SD大鼠(1天大)中分离新生大鼠心肌细胞。(2)95%N2和5%CO2充分饱和缺氧缓冲液,5%CO2、95%O2充分饱和复氧缓冲液构建心肌细胞H/R模型。(3)双荧光素酶报告基因检测启动子MFN1与转录因子RBP-Jκ相互作用。(4)CHIP法检测启动子MFN1与转录因子RBP-JκProtein-DNA相互作用。(5)EMSA法检测启动子MFN1与转录因子RBP-JκProtein-DNA相互作用。4.Notch1抑制线粒体裂解对心肌缺血再灌注损伤保护作用的体内验证(1)从SD大鼠(1天大)中分离新生大鼠心肌细胞。利用pAdeasy TM载体系统制备了表达大鼠NICD、MFN1和DRP1互补DNA(cDNA)的重组腺病毒感染原代心肌细胞,病毒感染复数MOI=50。(2)戊巴比妥钠(70 mg/kg)腹腔注射,气管插管,机械通气,频率60~80/min,潮气量2~3 m L/100 g,吸呼比1:1.2。左第4肋间进胸,剪开心包,心大静脉与左心耳相交处下方2-3 mm置6-0滑线,两端穿过长0.7 cm弹性P50软管,平衡15 min后结扎左冠状动脉前降支和P50管,形成局灶性心肌缺血,30 min后松开活结,撤离P50管,再灌注120 min构建I/R模型。(3)通过左室压力检测I/R大鼠心脏收缩功能。(4)Evans Blue及TTC染色测定I/R大鼠心肌梗死面积。(5)Western blot检测I/R大鼠心肌细胞MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和FIS1蛋白的表达。(6)扫描电子显微镜观察I/R大鼠心肌细胞的线粒体结构。结果:1.Notch1通过抑制线粒体裂解减轻心肌细胞缺血再灌注损伤(1)NICD过表达显著提高了H/R心肌细胞的细胞活力,而NICD敲除显著降低了H/R心肌细胞的细胞活力。(2)NICD过表达显著增加了H/R心肌细胞线粒体的延长数量,而NICD敲除显著增加了H/R心肌细胞线粒体的碎片数量。(3)NICD过表达H/R心肌细胞中明显减少,在NICD敲除的H/R心肌细胞中明显增加。(4)过表达NICD后H/R心肌细胞线粒体融合标记(MFN1、MFN2和OPA1)表达水平升高,而H/R心肌细胞线粒体裂解标记(DRP1和FIS1)表达水平下降。(5)NICD过表达显著改善H/R心肌细胞的ΔΨm;但是,NICD的下调对H/R心肌细胞ΔΨm没有影响。(6)在暴露于NICD过表达H/R的心肌细胞中,Cytochrome c水平明显降低。(7)暴露于NICD敲低H/R的心肌细胞线粒体通透性转换孔亚基(ANT、Cyp-d、PiC和VDAC)蛋白表达水平持续降低,表明H/R心肌细胞线粒体通透性转换孔被打开和损伤。2.Notch1通过调节MFN1和DRP1的表达减轻心肌细胞缺血再灌注损伤(1)敲除MFN1后,NICD过表达转染H/R心肌细胞的细胞活力明显受损;然而,NICD敲低转染H/R心肌细胞的细胞活力随着MFN1过表达而增加。(2)线粒体共聚焦显微镜分析显示,在NICD过表达转染H/R心肌细胞,MFN1基因敲低明显减少了线粒体的延长,而在NICD敲低转染的H/R心肌细胞中,MFN1过表达显著增加了线粒体的碎片。(3)敲除MFN1后,NICD过表达转染H/R心肌细胞凋亡明显增加。然而,NICD敲低转染H/R心肌细胞凋亡随着MFN1过表达而减少。(4)Western blot证实线粒体融合-裂解标记物(MFN1、MFN2、OPA1、DRP1和FIS1)在NICD过表达转染H/R心肌细胞MFN1基因敲除后降低,但在NICD敲低转染H/R心肌细胞MFN1过表达后升高。(5)NICD过表达转染H/R心肌细胞活力随着DRP1过表达而降低,而NICD敲低转染H/R心肌细胞活力随DRP1敲低而升高。(6)线粒体共聚焦显微镜分析显示,在NICD过表达转染H/R心肌细胞中,DRP1过表达明显减少了延长的线粒体,而在NICD敲低转染H/R心肌细胞中,DRP1敲低显著增加了破碎的线粒体结构。(7)在NICD高表达转染H/R心肌细胞组中,DRP1高表达显著增加了H/R心肌细胞的凋亡数量,而在NICD敲除转染的H/R心肌细胞组中,DRP1敲除后显著降低了H/R心肌细胞的凋亡数量。(8)Western blot证实线粒体融合-裂解标记物(MFN1/2、OPA1和FIS1)在NICD高表达转染H/R心肌细胞组中,DRP1过表达时降低,而在NICD敲除转染的H/R心肌细胞组中,DRP1敲低时升高。3.转录因子RBP-Jκ激活MFN1在心肌细胞缺血再灌注损伤细胞中的表达(1)RBP-Jκ过表达显著诱导野生型MFN1启动子活性,但未能诱导突变型MFN1启动子活性。(2)染色质免疫沉淀法评价RBP-Jκ与MFN1启动子区之间的直接相互作用显示,MFN1的启动子区域在RBP-Jκ免疫沉淀成分中显著富集。(3)ChIP-PCR试验证明RBP-Jκ与MFN1启动子区域的直接相互作用。(4)电泳迁移试验进一步证实RBP-Jκ与MFN1启动子区域的直接相互作用。4.Notch1抑制线粒体裂解对心肌缺血再灌注损伤保护作用的体内验证(1)缺血前收缩参数各组间相似,而I/R(30 min/45 min)抑制左室收缩功能,其特征是左室发展压(LVDP)、左室舒张末期压(LVEDP)和左室压力上升和下降的最大速度(±dp/dt),然而NICD过表达组明显减轻。NICD过表达I/R大鼠缺血前收缩参数受到MFN1或DRP1过表达的损害,而NICD过表达大鼠缺血前收缩参数则相反地受到MFN1过表达或DRP1过表达的改善。(2)在灌注2h后,NICD过表达能显著抑制梗死面积,与NICD敲低但MFN1过表达或DRP1敲低组具有相似的结果。(3)Western blot证实线粒体融合标记物(MFN2和OPA1)在MFN1基因敲低后降低,但在MFN1过表达或DRP1基因敲低后升高。然而,在NICD过表达组中,线粒体裂解标记物(FIS1)在敲低MFN1或DRP1后反向升高,而过表达MFN1后则降低。(4)电子显微镜观察线粒体结构显示,I/R大鼠心脏的许多线粒体病变发生了明显的改变,包括线粒体嵴破裂和基质肿胀,表明线粒体结构受损。然而,在NICD过表达和敲低中MFN1过表达或DRP1敲低中,这些损伤被减弱。结论:(1)Notch1通过抑制线粒体裂解减轻心肌细胞缺血再灌注损伤构建腺病毒载体的Ad-NICD显著提高了H/R心肌细胞的细胞活力,心肌细胞线粒体的延长数量。另外,我们发现凋亡细胞在NICD过表达H/R心肌细胞中明显减少。此外,Western blot发现过表达NICD后H/R心肌细胞线粒体融合标记(MFN1、MFN2和OPA1)表达水平升高,而线粒体裂解标记(DRP1和FIS1)表达水平下降。NICD过表达显著改善H/R心肌细胞的ΔΨm。在暴露于NICD过表达H/R心肌细胞中,胞浆细胞色素c水平明显降低。暴露于敲降NICD H/R心肌细胞的线粒体通透性转换孔亚基(ANT、Cyp-d、PiC和VDAC)蛋白表达水平下降,表明H/R心肌细胞线粒体通透性转换孔打开,加重心肌IRI损伤。(2)Notch1通过调节MFN1和DRP1的表达减轻心肌细胞缺血再灌注损伤Notch1通过RBP-Jκ依赖的MFN1和DRP1转录激活,在暴露于心肌H/R的心肌细胞中调节线粒体融合和裂解之间的动态平衡。另一方面,下调DRP1的表达,抑制线粒体裂解。异常融合和裂解引起线粒体紊乱导致心肌I/R。我们的研究进一步表明Notch1可以减少线粒体裂解,减少心肌梗死面积,抑制心室重构,发挥心肌保护作用。这种对心脏的保护作用几乎被MFN1敲低或DRP1过表达所逆转,这表明Notch1信号通路的保护作用依赖于MFN1/DRP1调节的线粒体融合-裂解动力学。(3)转录因子RBP-Jκ激活MFN1在心肌细胞缺血再灌注损伤细胞中的表达RBP-Jκ过表达显著诱导野生型MFN1启动子活性,但未能诱导突变型MFN1启动子活性;MFN1的启动子区域在RBP-Jκ免疫沉淀成分中显著富集;RBP-Jκ与MFN1启动子区域的直接相互作用。(4)Notch1抑制线粒体裂解对心肌缺血再灌注损伤保护作用的体内验证缺血前心脏收缩及舒张相关参数各组间相似,而I/R(30 min/45 min)抑制左室收缩及舒张功能,收缩功能的特征参数为左室发展压(LVDP)和左室内压力最大上升速率(+dp/dt),舒张功能的特征参数为左室舒张末期压(LVEDP)和左室内压力最大下降速率(-dp/dt),而NICD过表达组左室收缩及舒张功能损伤均明显减轻。NICD过表达组大鼠心脏损伤的改善会受到MFN1或DRP1的影响。另外,我们发现在灌注2 h后,NICD过表达能显著抑制梗死面积,与NICD敲低但MFN1过表达或DRP1敲低组具有相似的结果。Western blot证实了线粒体融合标记物(MFN2和OPA1)在MFN1基因敲低后降低,但在MFN1过表达或DRP1基因敲低后升高。然而,在NICD过表达组中,线粒体裂解标记物(FIS1)在敲低MFN1或过表达DRP1后反向升高,而过表达MFN1后则降低。电子显微镜观察线粒体结构显示,I/R心肌细胞的许多线粒体病变发生了明显的改变,包括线粒体嵴破裂和基质肿胀。然而,在NICD过表达组和NICD敲低但MFN1过表达或DRP1敲低的组中,这些损伤被减弱。