微生物转化井冈霉素制备假氨基糖类α-糖苷酶抑制剂的研究

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α-糖苷酶抑制剂在糖尿病治疗中发挥着重要作用,井冈胺作为α-糖苷酶抑制剂以及合成降糖药物的中间体,有着重要的药用价值和广阔的市场前景。由于井冈胺的化学合成工艺复杂,步骤繁多,利用生物转化制备井冈胺已成为当下研究热点。本论文利用生物农药井冈霉素为原料,对利用微生物转化井冈霉素制备井冈胺进行了系统研究。本文通过碱水解阿卡波糖的方法制备井冈胺粗品,利用732阳离子交换树脂和DOWEX1×2阴离子交换树脂纯化井冈胺粗品以制备井冈胺标准品。对井冈胺的TLC及HPLC检测条件进行了优化,优选出井冈胺的TLC检测条件为:展开剂:正丙醇:冰乙酸:水=4:1:1;显色剂:1%茚三酮溶液;显色方法:。对井冈胺柱前衍生化反应条件的研究结果表明:随着温度和时间的增加,衍生化反应程度更为充分,最终优选出的衍生化反应条件为:反应体系为:1%对氟硝基苯和1.5%三乙胺的二甲基甲酰胺溶液;反应水浴温度100℃;反应时间60min。衍生化产物HPLC检测的优选条件为:色谱柱:Phenomenex Gemini C18色谱柱;流动相:乙腈-水(15:85);柱温:30℃;流速:1ml/min;检测波长:398nm。利用采自不同区域的20份土样,在井冈霉素作为唯一碳源的培养基中进行转化菌株筛选,从中分离出细菌59株,真菌23株。以底物井冈霉素消耗量和产物井冈胺生成量为指标,采用TLC对82种微生物进行初筛,得到2株具有转化井冈霉素生成井冈胺的细菌。再以井冈胺产量为指标进行HPLC复筛,最终得到一株具有较高转化能力的菌株,编号为Vali-2。利用形态学观察、生理生化实验以及分子生物学方法对菌株Vali-2进行鉴定。通过形态学观察,Vali-2为芽孢杆菌。Vali-2菌株生理生化实验研究表明,该菌为革兰氏阴性菌,菌株具有还原硝酸盐,液化明胶的能力;菌体可发酵葡萄糖产酸,但不产气;不可利用柠檬酸盐;菌体产生淀粉酶,过氧化氢酶;甲基红反应为阴性,VP反应结果不确定。分子生物学测序鉴定菌株Vali-2为芽孢杆菌属Bacillusoleronius。最终鉴定菌为芽孢杆菌属Bacillus oleronius。对菌株Vali-2转化井冈霉素产井冈胺的培养基组成和摇瓶发酵条件进行了初步优化,结果优选培养基为:蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.7%、磷酸二氢钾0.3%、无水磷酸镁0.01%。最佳转化条件为:底物井冈霉素浓度1%,培养液初始pH8.0,培养时间4d,装液量50/250ml,接种量15%。在此转化条件下井冈霉素的转化率最高,产物井冈胺的产量最高。
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