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动物是流感病毒重要储存库,使流感病毒基因片段重配产生新型流感病毒成为可能。近年来新型重组禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）不断出现,包括H7Nx、H5Nx、H10Nx等,给家禽业和公共卫生带来很大威胁。2013年我国首次报道的低致病性H7N9亚型AIV,是不同亚型流感病毒基因重组产生的新型重组病毒,对鸡呈低致病性,但是可以感染人引起发病甚至死亡;在2016年底H7N9AIV HA基因发生突变成为高致病性AIV,至今仍在我国部分养禽地区流行。H7N9病毒是目前感染人病例数最多的AIV亚型,而且人感染H7N9病毒都是通过直接或间接接触家禽。流感病毒致病性和宿主适应性的改变通常与囊膜蛋白（HA和NA）和聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）的氨基酸变异有关,血凝素蛋白（HA）是流感病毒致病性和宿主范围的主要决定因素,而神经氨酸酶（NA）与AIV受体结合、病毒粒子释放相关,聚合酶蛋白对于病毒复制和宿主适应具有重要作用,均是AIV跨种传播的重要病毒蛋白。因此监测H7N9 AIV聚合酶蛋白和囊膜蛋白上与哺乳动物适应性相关的氨基酸突变,探究这些突变引起AIV感染哺乳动物的分子机制,对于防控禽流感的潜在大流行具有重要指导意义。1.小鼠致病性差异的H7N9亚型AIVs的生物学特性测定在对华东地区流行病学调查过程中,我们分离到2株H7N9毒株A/chicken/Eastern China/JTC4/2013（JTC4）和A/chicken/Eastern China/JTC11/2013（JTC11）。体外试验表明,2株病毒均具有双受体结合特性;2株病毒在禽源细胞上复制缓慢且效率相当,但JTC11在哺乳源细胞中的复制能力显著强于JTC4,说明JTC11对哺乳动物的适应性较好。动物试验结果表明,2株病毒对SPF鸡都呈低致病性,但JTC11对小鼠呈中等致病性（MLD50=3.8log10 EID50）,以106.0 EID50的高剂量病毒感染小鼠,不仅可以在鼻甲骨和肺脏内检测到高滴度的病毒,也可以突破血脑屏障进入脑内复制,并且还可以扩散到肾脏。相反JTC4对小鼠呈低致病性（MLD50＞6.5 log10 EID50）在各脏器都未检测到病毒复制。遗传进化分析表明,这2株病毒遗传距离较近,全基因组仅存在6个氨基酸差异,分别位于聚合酶蛋白（PB2-E627K、PB1-V719M和PA-N444D）和囊膜蛋白（HA-V223G和NA-N322S,G389D）上。综上所述,我们将这2株遗传背景相似对小鼠致病力存在差异的H7N9 AIVs作为研究H7N9 AIV跨种传播机制的模式病毒,这些差异氨基酸可能是引起它们复制能力和致病性差异的关键原因。2.聚合酶蛋白协同作用增强H7N9亚型AIVs对小鼠致病力以JTC4为骨架,构建聚合酶蛋白单点突变毒株（rJTC4-PB2-627K,rJTC4-PB1-719M和 rJTC4-PA-444D）以及多点联合突变毒株（rJTC4-PB2-627K+PB1-719M,rJTC4-PB2-627K+PA-444D,rJTC4-PB1-719M+PA-444D 和 rJTC4-PB2-627K+PB1-719M+PA-444D）并测定这些毒株对小鼠的致病力。小鼠致病性实验结果表明,聚合酶蛋白任何单点突变株对小鼠的致病性均为低致病性,与骨架病毒JTC4 一致;而任意2个或者3个氨基酸位点协同作用在106.0 EID50感染剂量下都会导致小鼠死亡,其中PB2-627K、PB1-719M、PA-444D 3个位点联合突变对小鼠致病力增强最为显著,其MLD50值可达4.833log10EID50,其次为PB2-627K与PB1-719M或PA-444D 2个位点联合突变可以致80%小鼠死亡（MLD50为 5.625 log10EID50）;多点突变株均可在肺、鼻甲骨高水平复制,PB2-627K联合PB1-719M和/或PA-444D突变株均可在脑、肾复制,但在脑中的复制水平较低,PB1-719M和PA-444D联合突变株在脑、肾中未检测到复制;突变株均引起肺脏不同程度的病理损伤,诱导免疫相关的细胞因子表达上调,其中rJTC4-PB2-627K+PB1-719M引起肺炎性细胞浸润和出血显著,细胞因子表达水平几乎与JTC11相当。聚合酶蛋白联合突变后在哺乳动物细胞中的聚合酶活性显著增强,突变株复制水平显著上升,但是在CEF细胞上复制水平低。综上所述,与哺乳动物致病性相关的聚合酶蛋白分子标记PB2-627K协同PB1-719M或PA-444D显著增强病毒对小鼠的致病性,特别是PB2-627K、PB1-719M协同突变后对小鼠肺脏的损伤极为显著,为H7N9AIV的监测和防控提供理论参考。3.PB2-627K与NA协同作用增强H7N9亚型AIVs对小鼠的致病力流感病毒对宿主的致病性是多基因共同作用的结果,PB2-627K是对哺乳动物致病性的重要分子标记,禽流感病毒发生PB2-E627K突变通常对哺乳动物并不致病,说明还有其他关键氨基酸位点与AIV在哺乳动物中的复制和致病力密切相关。通过反向遗传学技术进行差异氨基酸的定点突变,发现PB2-627K与HA或者NA单个位点联合突变毒株（rJTC4-627K+HA-223G,rJTC4-627K+NA-322S 和 rJTC4-627K+NA-389D）可以引起小鼠体重下降但不改变对小鼠的致病性;PB2-627K与NA-322S+389D协同作用,提高了病毒的NA酶活性,促进了病毒在小鼠肺脏和脑内的复制,肺组织中细胞因子表达水平上升,最终增强对小鼠的致病性。更重要的是NA-322S分子标记在禽源和人源H7N9毒株中占比较高,需要在流行病学调查过程对H7N9病毒NA-322S做重点监测。综上所述,我们的研究新发现了 PB2-627K与NA-322S+389D协同作用显著增强了 H7N9亚型AIV对小鼠的致病性,其中NA-322S需要重点关注,为防范H7N9病毒跨种传播及在未来可能存在的大流行提供了预警信息。