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背景与目的：
脑梗死是一种具有高发病率、致残率及病死率的疾病,目前尚缺乏有针对性的治疗策略。转化生长因子β1(transforming growth factor-βl,TGF-β1)作为一种多功能细胞因子,在细胞的生长、分化及组织损伤修复等方面存在着重要的调控作用。成年哺乳动物室管膜下区(subventricularzone,SVZ)神经干细胞的发现为脑血管疾病的治疗带来了新思路。已有研究证实,脑室内或脑实质注射神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)可促进脑梗死后SVZ神经发生。但药物扩散受限、手术创伤及感染的存在,限制了这两种给药方式在临床上的广泛应用。而血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的存在,使外周给药后进入中枢神经系统(central nervous system,CNS)内的NTFs非常有限。
经鼻嗅觉通路给药可避开BBB的阻碍,直接将药物递送入CNS,具有无创、给药方便、起效快、无首过效应及全身副反应小等优点。我们前期的研究已证实,TGF-β1经鼻给药后可高浓度地分布于大鼠CNS中,并通过调控其受体TβRI、TβRII的基因表达对抗谷氨酸介导的神经元损伤。本研究首先采用经鼻给予成年小鼠重组人TGF-β1(recombinant human TGF-β1,rhTGF-β1),检测药物在小鼠各脑区的分布情况。进而观察TGF-β1经鼻给药对正常及脑梗死小鼠SVZ神经干细胞增殖、迁移及分化的影响,以及对脑梗死的治疗作用。
方法：
本课题采用成年雄性C57/BL6小鼠作为实验动物。将小鼠随机分为TGF-B1组和对照组,分别单次经鼻给予20μl TGF-β1(50μg/ml)或生理盐水。采用酶联免疫吸附法观察给药后0.5、1、2、6 h嗅球、纹状体、皮层、海马、丘脑及脑干内TGF-β1的含量变化。
为评估TGF-β1经鼻给药对正常小鼠SVZ神经发生的影响,我们将小鼠随机分为’TGF-β1组和对照组,分别经鼻给予20μl TGF-β1(50μg/ml)或生理盐水,每日1次,连续2 d。首次经鼻给药后2 h起连续3 d腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶(BrdU,50mg/kg)标记新生细胞。采用免疫酶染色及激光共聚焦方法,分别观察给药后嗅球及SVZ的BrdU阳性细胞、BrdU与未成熟神经元标志物doublecorting(DCX)、成熟神经元标志物neuronal nuclear antigen(NeuN)及神经胶质细胞标志物glial fibrillary acid protein(GFAP)的双标情况。
建立小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MACO)模型,将小鼠随机分为TGF-β1组和对照组。在MACO术后2 h及24 h,分别每日1次经鼻给予20μl TGF-β1(50μg/ml)或生理盐水。自MCAO术后24 h起连续3 d腹腔注射BrdU(50mg/kg)标记新生细胞。采用免疫酶染色及激光共聚焦方法,观察MCAO术后损伤侧SVZ及纹状体中BrdU阳性细胞、BrdU+/DCX+、BrdU+/NeuN+、BrdU+/GFAP+细胞数变化。并应用TUNEL染色观察MCAO术后7 d梗死灶周的凋亡细胞数。采用HE染色及改良神经功能损害评分(modifiedNeurological Severity Scores,mNSS),对小鼠脑梗死体积及神经功能进行评定。
结果：
经鼻给药30 min后,小鼠嗅球、纹状体、皮层内TGF-β1浓度显著增高,于给药后60 min达到高峰,并维持较高浓度长达2 h,6 h后TGF-β1浓度逐渐下降。经鼻给药后60 min,TGF-β1组丘脑、海马内药物浓度也较对照组相比有所增高。在TGF-β1浓度到达最高峰时,嗅球内药物浓度最高,约为对照组的3倍,皮层、纹状体、丘脑、海马内药物浓度约为对照组的2倍。
经鼻给予TGF-β1后7、28 d,正常小鼠嗅球内BrdU阳性细胞数分别比对照组增加约2倍和3倍,而SVZ的BrdU阳性细胞数在两组间无差异。经鼻给药后7 d,嗅球内BrdU+/DCX+细胞数明显多于对照组,但两组间SVZ的BrdU+/DCX+细胞数差异不显著。经鼻给药后28 d,TGF-β1组嗅球内BrdU+/NeuN+细胞数明显增多,但两组间BrdU+/GFAP+细胞数差异不显著。
经鼻给予TGF-β1可显著增加MCAO术后7、14、21、28 d小鼠损伤侧SVZ和纹状体内BrdU阳性细胞数。MCAO术后7 d,TGF-β1组SVZ和纹状体内BrdU+/DCX+细胞数与对照组相比明显增加。MCAO术后28 d,TGF-β1组纹状体内BrdU+/NeuN+细胞数明显多于对照组,但两组中纹状体内BrdU+/GFAP+细胞数未见显著差异。
MCAO术后7d的TUNEL染色结果显示,经鼻给予TGF-β1可减少梗死灶周凋亡细胞数。HE染色及mNSS评分显示,经鼻给予TGF-β1可显著减少小鼠MCAO术后的脑梗死体积,促进小鼠的神经功能恢复。
结论：
经鼻给药可将TGF-β1递送入并广泛分布于小鼠脑内。经鼻给予TGF-β1可促进正常及脑梗死小鼠的神经发生。TGF-β1经鼻给药可减轻神经细胞损伤,减少脑梗死体积,促进神经功能恢复。