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研究背景: 支气管哮喘的主要病理改变是气道炎症、平滑肌功能紊乱和气道重塑。其中气道重塑是固定性气流受限、肺功能受损的病理生理基础。气道重塑的病理表现包括上皮功能与结构的改变、微血管的重构、平滑肌的增生与肥大等。其中气道上皮的异常表现为对不同应激因素的易感性增强,以及损伤后的异常修复。上皮细胞被认为是在组织损伤时最具活性的组织细胞之一。在上皮细胞自身修复的过程中,成熟上皮细胞分泌多种炎前因子,如胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、白介素25(IL-25)、白介素33(IL-33)等刺激基质部分的重塑过程,TSLP是由气道上皮特应性损伤后释放,从而诱导气道炎症的关键因子,其受体TSLPR(胸腺基质淋巴细胞生成素受体)可以通过白介素13(IL-13)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和信号传导与转录激活因子3(Stat3)介导炎症反应。TSLP可激活MAPKs的三类蛋白激酶(P38、JNK和ERK1/2),进一步诱导诱导Stat3磷酸化,引起炎症细胞因子、趋化因子的释放,参与气道炎症反应。 衰老是一种重要的防御机制,主要起源于对端粒的侵蚀和应激反应。细胞衰老在多种慢性疾病如慢性阻塞性肺疾病和哮喘的组织中较为常见。慢性炎症反应是哮喘一个重要的组织学特点,并且在气道重塑中发挥着重要的作用,慢性炎症也是组织应激反应的一种表现形式。因此,在哮喘气道上皮中发生细胞衰老不足为奇。P16和p21均参与了细胞衰老过程。有研究发现,哮喘患者p21的上调,且其上调水平和哮喘的严重性密切相关。在哮喘的发生发展过程中,一些细胞因子,如硫氧化还原蛋白(TRX)可通过降低气道上皮细胞TGF-β1、EGFR和p21的表达,进一步阻止哮喘小鼠气道重塑模型的建立。 根据国内外该领域的研究,目前尚未解决的问题是①TSLP在哮喘气道重塑中的作用;②TSLP能否通过Stat3信号通路诱导哮喘气道重塑;③细胞衰老是否参与哮喘气道重塑,及细胞衰老在TSLP诱导的哮喘气道重塑中作用机制尚不明确,均需进一步探讨。 研究目的: 1.探讨TSLP在哮喘气道重塑中的作用; 2.研究TSLP通过Stat3信号通路在哮喘气道重塑中发挥的作用 3.探索细胞衰老在哮喘气道重塑中的作用,及细胞衰老对TSLP诱导的哮喘气道重塑中的影响; 4.在小鼠模型中,通过针对Stat3的靶向治疗,评估干预Stat3信号通路对哮喘气道重塑及细胞衰老的影响。 研究方法: 1.首先我们采用苏木精-伊红染色法(HE染色)观察哮喘病人气道粘膜上皮的气道重塑情况。为了明确TSLP、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原蛋白在气道粘膜上皮表达情况,我们从哮喘患者(n=10)和正常人(n=10)分别获取了支气管镜活检标本,并用特异的抗体分别对其行免疫组织化学染色,同时对衰老标记物p16、p21、ki67进行检测。 2.为了明确TSLP调控的信号通路的特征,首先我们采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测人类肺成纤维细胞(HLF-1)是否表达TSLP受体(TSLPR)。我们用TSLP-shRNA或者TSLP质粒转染HLF-1下调或上调TSLP表达,采用westernblot和实时定量PCR(qPCR)方法进行检测相应下游Stat3磷酸化水平,及在蛋白和mRNA水平检测α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达情况。为了进一步明确HLF-1细胞中的TSLP是否通过Stat3信号通路诱导哮喘气道重塑,我们使用Stat3抑制剂处理经TSLP质粒转染的HLF-1,采用实时定量PCR和westernblot方法分别在mRNA和蛋白水平检测了α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。 3.同时,我们在人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)中,观察TSLP能否通过Stat3信号通路诱导气道重塑,及细胞衰老在TSLP诱导的哮喘气道重塑中的作用。首先采用TSLP重组蛋白刺激BEAS-2B,通过westernblot方法检测Stat3磷酸化水平和α-SMA及Ⅰ型胶原表达情况,同时采用westernblot、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)分析法、细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色法、免疫荧光细胞化学技术检测TSLP在支气管上皮细胞衰老中的作用。我们首先应用p16shRNA、p21shRNA转染BEAS-2B,然后再使用TSLP刺激BEAS-2B,采用westernblot方法检测Stat3磷酸化水平和α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白表达情况,采用BrdU分析法、SA-β-Gal、MTT分析法检测TSLP对人气道上皮细胞衰老的影响。同时,我们使用Stat3小分子抑制剂WP1066处理被转染的BEAS-2B后,再使用TSLP刺激细胞,通过westernblot检测哮喘气道重塑标记物α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白及细胞衰老标记物p16和p21的影响。通过BrdU分析法、SA-β-Gal方法观察Stat3小分子抑制剂对支气管上皮细胞细胞胞衰老的影响。 4.在哮喘的小鼠模型中,通过腹腔注射Stat3的靶向抑制剂WP1066,来检测如果抑制细胞衰老是否会影响哮喘的气道重塑。我们采用小鼠肺功能方法检测各组小鼠气道高反应性,采用免疫组织化学方法检测各组小鼠气道上皮重塑标记物α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白,以及细胞衰老标记物p16、p21和ki67的表达情况。 研究结果: 1.通过HE染色,我们在哮喘病人气道粘膜上皮中发现明显重塑病理表现。通过免疫组织化学方法,我们发现气道上皮细胞中TSLP,及重塑标记物α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增高(分别为:p<0.05,p<0.05,p<0.05)。衰老标记物p16及p21两者的蛋白水平在哮喘病人中是上调的(分别为p<0.05,p<0.05),ki67蛋白的表达水平较对照组降低(p<0.05)。 2.首先我们发现人肺成纤维细胞系HLF=1表达TSLP受体,HLF-1经TSLP-质粒转染后,通过westernblot分析法我们发现TSLP及Stat3磷酸化水平较对照组明显增高(分别为:p<0.05,p<0.05),α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白在蛋白水平和相应mRNA水平较对照组明显增高(分别为:p<0.05,p<0.05);在加入Stat3抑制剂之后,Stat3磷酸化、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白在蛋白和mRNA水平上的表达均下调,均有统计学意义。但是Stat5及其磷酸化水平无明显变化(p>0.05)。在转染TSLP-shRNA的HLF-1细胞中,通过westernblot、qPCR检测方法,我们发现TSLP、Stat3磷酸化水平、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显降低,均有统计学意义。 3.在支气管上皮细胞系BEAS-2B中,在用梯度TSLP处理细胞之后,我们发现TSLP诱导p16和p21的上调呈现TSLP剂量依赖的特征;TSLP可以增强Stat3磷酸化水平。同时我们通过BrdU标记法和SA-β-gal染色法发现,TSLP可以促进支气管上皮细胞衰老,通过免疫细胞荧光方法发现TSLP可以抑制ki67的表达,以上研究均有统计学意义。 我们使用shp16和(或)shp21稳定转染BEAS-2后,通过westernblot检测方法发现,单独沉默p16或p21并不能抑制TSLP刺激后引起的气道重塑标记物Ⅰ型胶原蛋白和α-SMA的表达以及Stat3的磷酸化水平,同时沉默p16和p21后可以抑制TSLP介导的气道重塑和Stat3的磷酸化;通过SA-β-gal染色法、BrdU分析法和MTT分析发现单独沉默p16或p21并不能抑制TSLP诱导的细胞衰老,同时沉默p16和p21却可以明显的抑制TSLP诱导的细胞衰老,以上研究均有统计学意义。 然后我们在BEAS-2B细胞中加入了Stat3的抑制剂WP1066,然后加入TSLP,通过westernblot检测,发现α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显较对照组降低,Stat3磷酸化水平明显受到抑制,同时发现p21和p16的表达亦明显受到抑制。通过SA-β-gal染色、BrdU分析法发现WP1066可以抑制TSLP诱导的支气管上皮细胞的衰老,以上研究均有统计学意义。 4.在哮喘小鼠模型中,通过腹腔注射Stat3的靶向抑制剂WP1066,我们通过监测小鼠肺功能发现鸡卵白蛋白(OVA)处理组小鼠气道反应性较正常对照组明显增高(p<0.05),WP1066处理组小鼠气道反应性较OVA组明显降低(p<0.05)。通过免疫组织化学染色方法,我们发现OVA组小鼠气道粘膜上皮哮喘重塑标记物α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增高(分别为:p<0.05,p<0.05),衰老标记物p16和p21表达较对照组明显增高(分别为:p<0.05,p<0.05),ki67表达较对照组明显降低(p<0.05);WP1066处理组小鼠α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平较OVA组明显降低(分别为:p<0.05,p<0.05),p16和p21表达较OVA组降低(分别为:p<0.05,p<0.05),ki67表达较OVA组增强(p<0.05)。 研究结论: 1.哮喘病人气道粘膜上皮TSLP高表达,伴随α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的过度表达;同时也伴随着衰老标记物p16和p21的高表达; 2.在人类肺成纤维细胞中,TSLP可以通过Stat3信号途径介导α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的上调,进而促进哮喘气道重塑; 3.在人支气管上皮细胞中,TSLP也可以通过Stat3信号途径介导α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的上调,进而促进哮喘气道重塑。同时TSLP诱导支气管上皮细胞衰老,通过干预Stat3信号途径可以抑制细胞衰老相关的气道重塑,说明细胞衰老在哮喘气道重塑的发生发展中起重要作用; 4.通过体内干预Stat3,可以抑制哮喘小鼠的气道重塑和细胞衰老,提示Stat3信号通路是一个潜在的有效治疗靶点。