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目的:基于传统中医药理论,结合鼻腔和大脑中枢神经系统之间的解剖学关系,利用药效实验筛选猪牙皂经鼻给药治疗中风的有效部位。
方法:1.以齐墩果酸和刺囊酸作为指标成分建立中药猪牙皂的含量测定项;2.采用系统溶剂法分离得到猪牙皂各个化学部位,并对各个化学部位进行药效学研究,初步筛选出具有治疗脑中风作用的有效部位;3.对猪牙皂有效部位进行提取、纯化工艺研究;4.建立大鼠脑缺血模型,采用大鼠经鼻给药方式,通过测定血液流变学、炎症因子、大脑水肿程度等相关指标,并利用HE染色观察脑组织结构改变、TUNEL法检测脑组织细胞凋亡、免疫组化法检测相关凋亡基因的表达,进一步验证并确定猪牙皂治疗中风的有效部位。
结果:1.猪牙皂药材UPLC含量测定条件:色谱柱为Agilent C18(150mm×4.6mm,5μm);柱温30℃;流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~13min,60%A→60%A,13~48min,60%A→68%A),流速:1.0mL·min-1,检测波长:215nm;2.与生理盐水组比较,猪牙皂正丁醇部位的祛痰作用更明显,且猪牙皂正丁醇部位能显著延长小鼠常压耐缺氧存活时间、亚硝酸钠中毒存活时间、急性脑缺氧存活时间;3.猪牙皂总皂苷提取最佳工艺为:液料比10∶1,75%乙醇水溶液回流提取3次,每次2h;最佳纯化工艺条件:上样质量浓度5.96mg·mL-1、上样流速为1.5mL·min-1、解析液为50%乙醇、解析流速为2.0mL·min-1;4.(1)各药物组对脑缺血模型大鼠血液流变学的影响:与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和中剂量组以及猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组均降低了脑缺血模型大鼠的全血粘度、全血还原粘度及血浆粘度(p<0.05);与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和中剂量组以及猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组均降低了脑缺血模型大鼠的电泳、红细胞聚集指数、刚性指数、红细胞压积(p<0.05);同时增加了脑缺血模型大鼠的红细胞变形指数(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的红细胞变形指数增加,刚性指数、红细胞压积均有降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。(2)脑水肿程度测定结果:与假手术组比较,模型组大鼠的脑指数、脑水肿显著增加(p<0.05);与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和中剂量组的脑指数、脑水肿均降低(p<0.05);猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的脑指数、脑水肿均降低(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的脑指数、脑水肿均有所降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。(3)血清中IL-1β、TNF-α测定结果:与假手术组比较,模型组大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均增加(p<0.05);与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和正丁醇中剂量组大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均降低(p<0.05);猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均降低(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均有所降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。(4)脑组织中MDA、NO、SOD测定结果:与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中的MDA、NO均增加(p<0.05);超氧化物歧化酶SOD减少(p<0.05):与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和正丁醇中剂量组大鼠脑组织中的MDA、NO均降低(p<0.05);猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的大鼠脑组织中的MDA、NO均降低(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的大鼠血清中的NO均有所降低,但差异无统计学意义(p>0.05),猪牙皂正丁醇高、中、低三个剂量组以及猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的大鼠脑组织中的超氧化物歧化酶SOD均增加(p<0.05)。(5)TUNEL细胞凋亡检测结果:与假手术组相比较,模型组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元细胞表达明显增多(P<0.05);与模型组比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元数明显减少(P<0.05);猪牙皂正丁醇高剂量组和正丁醇中剂量组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元数明显减少(P<0.05);从数值上看,猪牙皂正丁醇低剂量组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元细胞表达有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05)。(6)免疫组化检测结果:与假手术相比较,模型组大鼠大脑皮层Bax表达明显增多(P<0.05);与模型组相比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的Bax阳性神经元明显减少(P<0.05);猪牙皂正丁醇高、中、低三个给药组大鼠大脑皮层的Bax阳性神经元明显减少(P<0.05);与假手术相比较,模型组大鼠大脑皮层BCL-2表达明显增多(P<0.05);与模型组相比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的BCL-2阳性神经元明显增多(P<0.05);猪牙皂正丁醇高、中、低三个给药组大鼠大脑皮层的BCL-2阳性神经元明显增多,(P<0.05);与假手术相比较,模型组大鼠大脑皮层Caspase-3阳性神经元表达明显增多(P<0.05),与模型组相比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的Caspase-3阳性神经元明显减少(P<0.05);猪牙皂正丁醇高、中、低三个给药组大鼠大脑皮层的Caspase-3阳性神经元明显减少(P<0.05)。(7)脑组织病理形态学影响:假手术组大鼠的大脑皮层结构清晰,染色均匀,细胞核大而圆,呈蓝色,核仁明显;模型组大鼠的大脑皮层结构紊乱,核仁消失,细胞变形、肿胀,变性呈梭形或三角形,颜色深染呈蓝紫色;猪牙皂高剂量组大鼠的皮层结构相对清晰细胞核趋于假手术组,形状均匀变性细胞数量接近假手术组,核仁清晰,神经元排列较整齐,但未恢复至正常水平;猪牙皂总皂苷中剂量组大鼠的皮层结构相对紊乱细胞核形状不规则核仁相对明显变性细胞数量较皂低组有所减少;猪牙皂总皂苷低剂量组大鼠的大脑皮层结构不清晰,细胞变性不规则,少量神经元胞体呈三角形,不过变性细胞数量较模型组有所减少;猪牙皂正丁醇高剂量组大鼠的皮层结构相对清晰细胞核趋于正常形状均匀变性细胞数量减少但未恢复至正常水平;猪牙皂正丁醇中剂量组大鼠的皮层结构相对紊乱细胞核形状不规则核仁较正低组相对明显变性细胞数量进一步减少;猪牙皂正丁醇低剂量组大鼠的皮层结构较紊乱,细胞形状不均一染色不均匀,变性细胞有所减少。
结论:通过小鼠祛痰实验、小鼠常压耐缺氧实验、小鼠亚硝酸钠中毒缺氧存活实验和急性脑缺血性缺氧实验研究,结果显示猪牙皂正丁醇部位有明显的祛痰、耐缺氧作用,通过文献查阅,正丁醇部位主要含有大量三萜皂苷,即猜想猪牙皂中所含三萜类皂苷可能为治疗缺血性脑中风的有效部位,并对其进行提取、纯化工艺研究;通过永久性结扎大鼠两侧颈总动脉建立大鼠脑缺血模型,分别经鼻给与大鼠正丁醇部位和猪牙皂总皂苷部位,研究结果显示,两个给药组均能不同程度的降低脑缺血模型大鼠的脑组织水肿程度、改善模型大鼠血液流变学和炎症情况、降低自由基损伤、抗神经元细胞凋亡、改善脑组织形态学病理变化,即最后初步确定猪牙皂总皂苷为治疗中风的有效部位。
方法:1.以齐墩果酸和刺囊酸作为指标成分建立中药猪牙皂的含量测定项;2.采用系统溶剂法分离得到猪牙皂各个化学部位,并对各个化学部位进行药效学研究,初步筛选出具有治疗脑中风作用的有效部位;3.对猪牙皂有效部位进行提取、纯化工艺研究;4.建立大鼠脑缺血模型,采用大鼠经鼻给药方式,通过测定血液流变学、炎症因子、大脑水肿程度等相关指标,并利用HE染色观察脑组织结构改变、TUNEL法检测脑组织细胞凋亡、免疫组化法检测相关凋亡基因的表达,进一步验证并确定猪牙皂治疗中风的有效部位。
结果:1.猪牙皂药材UPLC含量测定条件:色谱柱为Agilent C18(150mm×4.6mm,5μm);柱温30℃;流动相:乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0~13min,60%A→60%A,13~48min,60%A→68%A),流速:1.0mL·min-1,检测波长:215nm;2.与生理盐水组比较,猪牙皂正丁醇部位的祛痰作用更明显,且猪牙皂正丁醇部位能显著延长小鼠常压耐缺氧存活时间、亚硝酸钠中毒存活时间、急性脑缺氧存活时间;3.猪牙皂总皂苷提取最佳工艺为:液料比10∶1,75%乙醇水溶液回流提取3次,每次2h;最佳纯化工艺条件:上样质量浓度5.96mg·mL-1、上样流速为1.5mL·min-1、解析液为50%乙醇、解析流速为2.0mL·min-1;4.(1)各药物组对脑缺血模型大鼠血液流变学的影响:与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和中剂量组以及猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组均降低了脑缺血模型大鼠的全血粘度、全血还原粘度及血浆粘度(p<0.05);与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和中剂量组以及猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组均降低了脑缺血模型大鼠的电泳、红细胞聚集指数、刚性指数、红细胞压积(p<0.05);同时增加了脑缺血模型大鼠的红细胞变形指数(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的红细胞变形指数增加,刚性指数、红细胞压积均有降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。(2)脑水肿程度测定结果:与假手术组比较,模型组大鼠的脑指数、脑水肿显著增加(p<0.05);与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和中剂量组的脑指数、脑水肿均降低(p<0.05);猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的脑指数、脑水肿均降低(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的脑指数、脑水肿均有所降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。(3)血清中IL-1β、TNF-α测定结果:与假手术组比较,模型组大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均增加(p<0.05);与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和正丁醇中剂量组大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均降低(p<0.05);猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均降低(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的大鼠血清中的IL-1β、TNF-α均有所降低,但差异无统计学意义(p>0.05)。(4)脑组织中MDA、NO、SOD测定结果:与假手术组比较,模型组大鼠脑组织中的MDA、NO均增加(p<0.05);超氧化物歧化酶SOD减少(p<0.05):与模型组比较,猪牙皂正丁醇高剂量组和正丁醇中剂量组大鼠脑组织中的MDA、NO均降低(p<0.05);猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的大鼠脑组织中的MDA、NO均降低(p<0.05),从数值上看猪牙皂正丁醇低剂量组的大鼠血清中的NO均有所降低,但差异无统计学意义(p>0.05),猪牙皂正丁醇高、中、低三个剂量组以及猪牙皂总皂苷的高、中、低三个剂量组的大鼠脑组织中的超氧化物歧化酶SOD均增加(p<0.05)。(5)TUNEL细胞凋亡检测结果:与假手术组相比较,模型组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元细胞表达明显增多(P<0.05);与模型组比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元数明显减少(P<0.05);猪牙皂正丁醇高剂量组和正丁醇中剂量组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元数明显减少(P<0.05);从数值上看,猪牙皂正丁醇低剂量组大鼠大脑皮层的TUNEL阳性神经元细胞表达有所减少,但差异无统计学意义(P>0.05)。(6)免疫组化检测结果:与假手术相比较,模型组大鼠大脑皮层Bax表达明显增多(P<0.05);与模型组相比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的Bax阳性神经元明显减少(P<0.05);猪牙皂正丁醇高、中、低三个给药组大鼠大脑皮层的Bax阳性神经元明显减少(P<0.05);与假手术相比较,模型组大鼠大脑皮层BCL-2表达明显增多(P<0.05);与模型组相比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的BCL-2阳性神经元明显增多(P<0.05);猪牙皂正丁醇高、中、低三个给药组大鼠大脑皮层的BCL-2阳性神经元明显增多,(P<0.05);与假手术相比较,模型组大鼠大脑皮层Caspase-3阳性神经元表达明显增多(P<0.05),与模型组相比较,猪牙皂总皂苷高、中、低三个剂量组大鼠大脑皮层的Caspase-3阳性神经元明显减少(P<0.05);猪牙皂正丁醇高、中、低三个给药组大鼠大脑皮层的Caspase-3阳性神经元明显减少(P<0.05)。(7)脑组织病理形态学影响:假手术组大鼠的大脑皮层结构清晰,染色均匀,细胞核大而圆,呈蓝色,核仁明显;模型组大鼠的大脑皮层结构紊乱,核仁消失,细胞变形、肿胀,变性呈梭形或三角形,颜色深染呈蓝紫色;猪牙皂高剂量组大鼠的皮层结构相对清晰细胞核趋于假手术组,形状均匀变性细胞数量接近假手术组,核仁清晰,神经元排列较整齐,但未恢复至正常水平;猪牙皂总皂苷中剂量组大鼠的皮层结构相对紊乱细胞核形状不规则核仁相对明显变性细胞数量较皂低组有所减少;猪牙皂总皂苷低剂量组大鼠的大脑皮层结构不清晰,细胞变性不规则,少量神经元胞体呈三角形,不过变性细胞数量较模型组有所减少;猪牙皂正丁醇高剂量组大鼠的皮层结构相对清晰细胞核趋于正常形状均匀变性细胞数量减少但未恢复至正常水平;猪牙皂正丁醇中剂量组大鼠的皮层结构相对紊乱细胞核形状不规则核仁较正低组相对明显变性细胞数量进一步减少;猪牙皂正丁醇低剂量组大鼠的皮层结构较紊乱,细胞形状不均一染色不均匀,变性细胞有所减少。
结论:通过小鼠祛痰实验、小鼠常压耐缺氧实验、小鼠亚硝酸钠中毒缺氧存活实验和急性脑缺血性缺氧实验研究,结果显示猪牙皂正丁醇部位有明显的祛痰、耐缺氧作用,通过文献查阅,正丁醇部位主要含有大量三萜皂苷,即猜想猪牙皂中所含三萜类皂苷可能为治疗缺血性脑中风的有效部位,并对其进行提取、纯化工艺研究;通过永久性结扎大鼠两侧颈总动脉建立大鼠脑缺血模型,分别经鼻给与大鼠正丁醇部位和猪牙皂总皂苷部位,研究结果显示,两个给药组均能不同程度的降低脑缺血模型大鼠的脑组织水肿程度、改善模型大鼠血液流变学和炎症情况、降低自由基损伤、抗神经元细胞凋亡、改善脑组织形态学病理变化,即最后初步确定猪牙皂总皂苷为治疗中风的有效部位。